GINS 2蛋白在宫颈癌组织中的表达情况及其与患者临床特征和预后的关系

王媛，惠双，张成辉，郭宏强，贺海发，杨如玉

南阳市中心医院1肿瘤内科，3病理科，4南阳市血液肿瘤实验室，河南南阳 473000

2郑州大学附属肿瘤医院内科，郑州 450008

宫颈癌是全球范围内重要的公共卫生问题，其进展缓慢、转移晚，临床症状显著，严重威胁女性患者的健康和生命。多数患者就诊时的病灶相对局限，且预后较差，5年生存率较低[1-4]，因此，深入探讨宫颈癌的发病机制对于宫颈癌的早期诊断、早期治疗以及宫颈癌患者生存质量的提高均具有重要的意义。GINS2蛋白（GINS complex subunit 2，GINS2）是含有两个Ca2+EF-hand域和一个亮氨酸/异亮氨酸富集区的多功能蛋白，在多种外周组织中正常表达，在下丘脑核中表达并参与能量平衡等生物过程；此外，其配体在胚胎发育、免疫系统调控、血管生成和肿瘤转移等方面发挥着重要的作用[5]，GINS2参与了胚胎发育、细胞增殖与分化、免疫和病毒感染等一系列生理活动[6-7]。目前，关于GINS2的研究主要集中在肺癌、乳腺癌方面，而关于GINS2表达与宫颈癌发生、发展关系的研究较少。因此，本研究通过探讨宫颈癌组织中GINS2蛋白的表达与患者临床特征及预后的关系，旨在为宫颈癌患者的早期诊断和治疗提供参考依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本选取

选取2011年3月至2015年1月南阳市中心医院肿瘤内科确诊的98例宫颈癌患者的宫颈癌组织作为观察组。宫颈癌患者的纳入标准：①初中以上文化水平，且年龄≥18岁；②无精神障碍史，可自由交流和沟通；③接受化疗≥2个疗程；④均行血常规、尿常规、血生化、宫颈病理组织检查。排除标准：①存在心源性休克和永久性心脏内传导紊乱；②合并严重精神类疾病；③治疗期间，同步接受其他肿瘤的化疗；④存在其他严重疾病。98例宫颈癌患者的年龄为48～67岁，平均年龄为（57.5±4.8）岁；体重为50～63 kg,平均体重为（56.1±4.1）岁；HPV阳性65例，HPV阴性33例。采用2012年版国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期标准[8]进行病理分期：Ⅰ～Ⅱ期52例，Ⅲ～Ⅳ期46例；病理类型：鳞癌85例，腺癌13例。选取同期24例健康体检者的正常宫颈组织作为对照组。健康体检者的年龄为50～68岁，平均年龄为（59.2±4.0）岁；体重为50～61 kg，平均体重为（55.3±3.1）kg。两组受试者的年龄和体重比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。全部患者及家属均对本研究知情同意并自愿签署知情同意书，且本研究经过南阳市中心医院医学伦理委员会的审批通过。

1.2 检测方法

1.2.1 GINS 2蛋白相对表达量的检测分别称取0.1 g正常宫颈组织和宫颈癌组织，采用微波粉碎器将宫颈组织碾磨成粉末状，将其转入2 ml无菌管中，加入1.5 ml磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）（pH 7.4），充分振荡混匀，4 ℃静止2 h，以4500 r/min离心20 min，离心半径为5 cm，收集上清液，采用酶联免疫吸附试验（enzymelinked immunoadsordent assay，ELISA）试剂盒（购于上海恒远生物科技有限公司）检测GINS2蛋白的相对表达量。

1.2.2 GINS 2蛋白阳性表达情况检测及结果判定采用免疫组织化学染色法检测GINS2蛋白在宫颈癌组织和正常宫颈组织中的表达情况。制作常规5 μm厚的石蜡切片，3%过氧化氢溶液常温阻断内源性过氧化氢酶，微波修复抗原，PBS常规冲洗，1%GINS2抗体工作液（购于英国Abcam公司），4 ℃过夜，加入二抗IgG（稀释浓度为1∶1000），室温孵育30 min，加入链霉素抗生物素蛋白-过氧化物，PBS冲洗，滴加二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色剂，苏木素复染，乙醇梯度水化，封片。每张切片随机选取5个高倍视野（×400），采用双盲法评估GINS2蛋白的阳性表达情况。GINS2蛋白阳性表达定位于细胞核。根据染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；根据阳性细胞所占百分比评分：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，＞50%为3分；两种评分相加，最终结果0～1分为阴性（-）；2分为弱阳性（+）；3～4分为强阳性（++）；5～7分为极强阳性（+++）。本研究将阴性和弱阳性归为阴性表达，强阳性和极强阳性归为阳性表达。

1.3 观察指标及随访

比较宫颈癌组织和正常宫颈组织中GINS2蛋白的表达情况，分析GINS2蛋白表达与宫颈癌患者临床特征和预后的关系。采用电话随访的方式对宫颈癌患者的生存情况进行随访，随访起始日期为术后第1天，随访截止日期为2018年1月1日。

1.4 统计学方法

采用Epidata录入数据，采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GINS 2蛋白的表达情况

宫颈癌组织中GINS2蛋白的相对表达量为（2.28±0.15）ng/g，明显高于正常宫颈组织的（0.78±0.12）ng/g，差异有统计学意义（t=45.506，P＜0.01）。宫颈癌组织中GINS2蛋白的阳性表达率为79.6%（78/98），明显高于正常宫颈组织的4.2%（1/24），差异有统计学意义（χ2=63.186，P＜0.01）（图1）。

2.2 不同临床特征宫颈癌患者宫颈癌组织中GINS 2蛋白的表达情况

图1 宫颈癌组织（n=98）和正常宫颈组织（n=24）中GINS 2蛋白的阳性表达情况（二氨基联苯胺法染色，×400）

不同年龄宫颈癌患者宫颈癌组织中GINS2蛋白的阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；不同病理类型、组织分化程度、TMN分期、浸润深度、淋巴血管间隙浸润情况、淋巴结转移情况宫颈癌患者宫颈癌组织中GINS2蛋白的阳性表达率比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 不同临床特征宫颈癌患者GINS 2蛋白的表达情况（n=98）

2.3 宫颈癌组织中GINS 2蛋白表达与患者预后的关系

截至随访结束，宫颈癌组织中GINS2蛋白阳性表达患者失访18例，死亡44例；GINS2蛋白阴性表达患者失访5例，死亡1例。GINS2蛋白阴性表达患者的3年生存率为70.0%（14/20），高于GINS2阳性表达患者的20.5%（16/78），差异有统计学意义（χ2=15.206，P＜0.05）。GINS2蛋白阴性表达患者的生存期为（27.5±5.98）个月，长于GINS2蛋白阳性表达患者的（13.8±6.43）个月，差异有统计学意义（t=20.369，P＜0.05）。

3 讨论

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，发病率逐年递增。本研究结果显示，宫颈癌组织中GINS2蛋白的相对表达量明显高于正常宫颈组织（P＜0.01），说明GINS2蛋白在宫颈癌组织中的表达水平较高。国外研究显示，GINS2蛋白对于肿瘤的发生、发展具有重要的调控作用，其具有时间、空间表达的特异性；若药物沉默GINS2蛋白表达，肿瘤细胞的生长能得到有效的抑制[5,7,9]。结合本次研究结果，提示GINS2蛋白可能成为宫颈癌治疗的分子靶点。本研究结果显示，宫颈癌组织中GINS2蛋白的阳性表达率明显高于正常宫颈组织（P＜0.01）。不同病理分型、组织分化程度、TMN分期、浸润深度、淋巴血管间隙浸润情况、淋巴结转移情况宫颈癌患者的宫颈癌组织比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），表明高表达的GINS2蛋白能够促进宫颈癌的进展。GINS2蛋白在对启动细胞的增殖具有重要的作用，并能抑制细胞的凋亡[10]。高表达GINS2蛋白的肿瘤细胞黏附内皮细胞的能力更强，而肿瘤细胞与内皮细胞仅有紧密结合才能够穿过细胞外基质层，建立转移灶GINS2蛋白可介导细胞的定向转移和趋化性，并激活淋巴细胞、内皮细胞、中性粒细胞、上皮细胞上相应的趋化因子受体，因此，高表达GINS2蛋白的肿瘤细胞在肿瘤的发展过程中发挥着重要的作用[11-12]。这与本研究结果中GINS2蛋白能够促进宫颈癌的进展的结果相符合。本研究中，GINS2蛋白阴性表达患者的3年生存率高于GINS2阳性表达患者，3年生存期长于GINS2蛋白阳性表达患者（P＜0.05），提示GINS2低表达能够抑制肿瘤的发展，使患者获得较好的预后。研究发现，GINS2能够调控BAX/Blc的表达水平，从而对细胞凋亡起到调控作用，具体表现为诱导Bcl-2高表达，形成异源二聚体BAX/BAX，从而抑制细胞凋亡[10]。

综上所述，GINS2蛋白在宫颈癌组织中的相对表达量和阳性表达率均较高，其在宫颈癌的发生、发展过程中起促进作用；GINS2蛋白低表达的宫颈癌患者能够获得较好的预后。由于本研究纳入的样本量较少，因此不可避免地存在选择偏倚，在本研究的下个阶段将扩大样本量，并通过细胞实验进一步探讨GINS2蛋白与宫颈癌发病机制的关系。