血清miRNA-21、IL-25表达水平与肾癌患者临床特征的关系

严璞，周永建，张勇

首都医科大学附属北京天坛医院泌尿外科，北京 100070

细胞学因子的改变或基因水平的相关改变，均能够通过影响肿瘤细胞的生物学特征，增强肿瘤细胞的增殖和侵袭能力[1]。微小RNA-21（microRNA 21，miRNA-21）表达水平升高时，能够通过加剧肿瘤细胞增殖，提高肿瘤细胞DNA的转录速度，进而促进肾癌患者的病情进展[2]。白细胞介素-25（interleukin 25，IL-25）是免疫调节性相关因子，能够通过提高T淋巴细胞的免疫活性，降低T淋巴细胞的免疫应答水平，进而促进肿瘤细胞的免疫逃逸[3]。相关研究对miRNA-21表达与膀胱癌的关系进行探讨，认为膀胱癌患者的miRNA-21表达水平明显增高，而且miRNA-21的表达水平与膀胱癌患者的临床特征密切相关[4]。但目前仍缺乏关于miRNA-21、IL-25的表达与肾癌关系的研究。本研究对首都医科大学附属北京天坛医院确诊的60例肾癌患者进行研究，探讨了miRNA-21、IL-25的表达情况及其与肾癌患者临床特征的关系，旨在为临床上肾癌患者的病情评估提供参考，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2015年7月至2017年12月于首都医科大学附属北京天坛医院确诊的肾癌患者60例为肾癌组。纳入标准：①符合中华医学会泌尿外科学会制定的《肾细胞癌诊治指南》中的标准[5]，Fuhrman分级为Ⅰ～Ⅲ级；②年龄36～65岁；③经计算机断层扫描（computed tomography，CT）、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）或病理学检查确诊。排除标准：①患有全身感染性疾病；②伴有免疫功能缺陷；③合并其他部位恶性肿瘤；④患有肾结石；⑤有放化疗史及免疫治疗史。选取同期于首都医科大学附属北京天坛医院体检的健康体检者60例为对照组。肾癌组患者中，男42例，女18例；年龄36～65岁，平均（48.2±9.3）岁；Fuhrman分级：Ⅰ级14例，Ⅱ级22例，Ⅲ级24例；肿瘤直径＞4 cm 23例，肿瘤直径≤4 cm 37例；肿瘤分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期23例，Ⅲ期16例，Ⅳ期5例；发生淋巴结转移15例，未发生淋巴结转移45例。对照组患者中，男40例，女20例；年龄35～65岁，平均（49.8±10.0）岁。两组患者的年龄、性别比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究获得医院医学伦理委员会的批准，所有受试者均对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.2 酶联免疫吸附测定法检测血清IL-25水平

采集健康体检者体检时和肾癌患者入院后24 h内或治疗后6～8 h的肘部静脉血4 ml，1500 r/min离心15 min，收集上清液。采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法检测血清IL-25水平，在每个聚苯乙烯板反应孔中加入上述收集的上清液0.1 ml，4℃过夜孵育；加入磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）洗涤3次，每次3 min；在每个聚苯乙烯板反应孔中加入IL-25抗体（1∶800，购自南京伯斯金生物公司），37℃孵育30 min；加入PBS洗涤3次，每次3 min；每孔中加入 3，3'，5，5'-四甲基联苯胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB）溶液底物0.1 ml，37 ℃20 min；加入2 mol/L硫酸0.05 ml终止反应。采用DG5033A酶标仪进行IL-25水平测定。

1.3 逆转录聚合酶链反应法检测血清miRNA-21水平

采集健康体检者体检时和肾癌患者入院后第2天的肘部静脉血4 ml，3500 r/min离心15 min后室温下放置30 min，收集上层液体，于-20℃条件下保存待检。采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）法检测miRNA-21的表达水平。采用上海雨婷生物科技公司生产的RNA提取试剂盒进行总RNA的提取，并逆转录成cRNA后进行基因扩增。以GAPDH为内参基因，采用Primer 5软件进行内参基因和目的基因的引物设计及合成，miRNA-21的上游引物：5'-TTTGGCTCTGACCATTCTGT-3'；下游引物：5'-GTCCTCACCTGAGGGACCCC-3'，经历40个循环后进行曲线溶解，每个孔设置3个复孔，取Threshhold设置下的Ct平均值，采用2-△△Ct法计算miRNA-21的表达水平，△Ct（n）=Ct目的基因（n）-Ct内参基因（n），△△CT（n）=△Ct（n）-△Ct（1）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清miRNA-21、IL-25表达水平的比较

肾癌组血清miRNA-21、IL-25表达水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。（表1）

表1 两组受试者血清miRNA-21、IL-25表达水平的比较（±s）

表1 两组受试者血清miRNA-21、IL-25表达水平的比较（±s）

组别miRNA-21 IL-25（pg/ml）肾癌组（n=60）对照组（n=60）t值P值8.44±3.92 1.60±0.78 13.256 0.000 107.4±47.2 66.8±16.5 6.290 0.000

2.2 不同临床特征肾癌患者血清miRNA-21、IL-25表达水平的比较

不同Fuhrman分级、肿瘤直径、肿瘤分期、淋巴结转移情况肾癌患者的血清miRNA-21表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同Fuhrman分级、肿瘤直径肾癌患者的血清IL-25表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；肿瘤分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移肾癌患者的血清IL-25表达水平高于肿瘤分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（t=2.490、3.763，P＜0.05）。（表2）

表2 不同临床特征肾癌患者的血清miRNA-21、IL-25表达水平（n=60）

3 讨论

肾癌的病情进展风险较高，远期整体生存预后较差。长期的临床随访观察研究发现，肾癌患者的中位生存时间、生存率等较差，治疗后患者生活质量的改善仍较为局限[6-7]。相关研究表明，手术及放化疗治疗后，肾癌患者的无瘤生存时间仍短于36个月，且病情控制满意度低于30%[8-9]。对肾癌患者血清中miRNA-21、IL-25的表达情况进行研究，不仅能够揭示肾癌病情进展的生物学机制，同时还能够为临床上肾癌的免疫靶向治疗、早期血清指标筛查或临床预后的随访提供参考。

miRNA-21是非编码RNA家族成员，能够通过调控肿瘤细胞的生物学特征，导致肿瘤细胞分化障碍，促进肿瘤细胞转录启动子的激活，从而促进肿瘤细胞增殖。miRNA-21还能够通过影响肿瘤细胞的变形和浸润能力，促进肿瘤细胞突破基底膜组织，从而导致泌尿系统移行上皮组织的损伤和破坏[2]。IL-25作为白细胞介素家族成员，其不仅能够参与炎性反应过程，还能够影响患者的自身免疫性调节过程。IL-25的表达水平升高时，能够通过抑制树突状细胞的抗原提呈功能，降低T淋巴细胞对肿瘤细胞的捕捉和吞噬能力，进而促进肿瘤细胞的逃逸。在生物学水平进行的相关研究表明，IL-25能够参与肿瘤细胞周期的调控紊乱过程，加速肿瘤细胞的持续性自我扩增[10]。

本研究通过对肾癌患者血清中miRNA-21、IL-25的表达情况进行研究，结果显示肾癌患者的血清miRNA-21、IL-25表达水平均较健康体检者明显升高（P＜0.01），提示miRNA-21、IL-25高表达，均能够参与到肾癌的病情进展过程。这主要由于miRNA-21、IL-25的表达上调，能够通过下列机制影响肾癌的发生、发展[11-12]：①miRNA-21表达水平升高，不仅能够影响肿瘤细胞的生物学特征，还能够激活肿瘤细胞内肿瘤信号通路，从而促进肿瘤细胞的DNA复制和分裂速度；②IL-25表达水平升高，不仅能够影响肿瘤细胞的T淋巴细胞免疫调控，还能够提高肿瘤细胞G1/S期的比值，促进肿瘤细胞快速跨越G0期。杨益等[12]研究结果显示，相比于健康对照组，肾癌组患者的miRNA-21表达水平可平均上升55%左右，同时在合并有明显腹腔积液或肿瘤恶病质的患者中，miRNA-21的表达水平可进一步上升，该结果与本研究结果相一致。本研究在对miRNA-21、IL-25表达与肾癌患者临床特征的关系的探讨中发现，有淋巴结转移、肿瘤分期较晚、肿瘤直径较大的肾癌患者的血清miRNA-21表达水平均无明显上升，推测miRNA-21的表达可能与肾癌患者的上述临床特征并无明显的关系。考虑其原因可能与本研究纳入的肾癌患者的病例数量不足、miRNA-21检测灵敏度的差别等有关。但肿瘤分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移肾癌患者的血清IL-25表达水平高于肿瘤分期为Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移的患者（P＜0.05），提示IL-25的表达对肾癌患者的临床特征具有一定的影响，究其原因可能为IL-25表达水平升高，能够促进肿瘤细胞浸润深度的增强，促进临床分期的进展，同时IL-25还能够提高肿瘤细胞黏附淋巴结组织的能力，进而促进肾癌淋巴结转移的发生。

综上所述，肾癌患者的血清miRNA-21、IL-25表达水平均明显上升，且IL-25的表达水平与肾癌患者的肿瘤分期、淋巴结转移情况有关。但本研究未能深入探讨miRNA-21、IL-25的表达与肾癌患者临床转归的关联，故仍有待更进一步的深入研究。