DAB 2IP和 β-catenin在胃癌组织中的表达及临床意义

宋志明，高明，王颖霞，申丽娟

郑州大学第一附属医院1康复医学科，2肿瘤科，郑州 450052

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一。根据中国癌症流行病学的统计数据显示，尽管中国胃癌的发病率呈现逐渐降低的趋势，但由于中国的人口基数庞大，且老龄化速度加快，胃癌仍是仅次于肺癌的具有高发病率和高病死率的恶性肿瘤[1]。胃癌的起病较为隐匿，当胃癌患者出现疼痛、恶心、呕吐和消瘦等临床症状时常已进展至中晚期。既往研究发现，胃癌的发生、发展受多基因、多因子的调控，但目前仍缺乏被广泛认可的特异性肿瘤标志物，因此，寻找快速、有效的胃癌诊断和预后评估生物学指标是目前的研究热点[2]。人DAB2相互作用蛋白（disabled homolog 2-interacting protein，DAB2IP）是Ras-鸟苷三磷酸酶激活蛋白（Ras guanosine triphosphatase activating protein，Ras-GAP）家族的成员之一，能够通过介导多种信号通路调控细胞的周期，并抑制肿瘤的生长、分化及新血管的生成[3]。β-连环蛋白（β-catenin）是上皮钙黏素-连环素复合体的重要组成部分，具有细胞黏附和识别的双重功能，是WNT信号转导通路的关键分子，在WNT靶基因介导的细胞增殖、分化及肿瘤的浸润和侵袭过程中发挥着重要的作用[4]。Xie等[5]进行了关于前列腺癌的研究，发现DAB2IP可通过调节糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）-β-catenin信号通路诱导上皮-间充质干细胞的转化。朱鹏武等[6]发现，胃癌组织中DAB2IP和β-catenin的异常表达与胃癌的临床分期、浸润深度和淋巴结转移情况有关。但目前关于DAB2IP和β-catenin在胃癌组织表达的相关性及与患者临床特征的关系仍鲜有报道。基于以上研究背景，本研究拟对行胃癌根治术的95例患者的术后标本进行DAB2IP和β-catenin阳性率的检测，旨在分析DAB2IP和β-catenin在胃癌患者胃癌组织中的阳性表达情况及其对患者预后的评估价值，为进一步探索二者在胃癌发生、发展过程中的潜在分子学机制奠定基础。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料选取

选取2008年7月至2012年9月于郑州大学第一附属医院治疗的胃癌患者95例，留取其胃癌切除新鲜组织标本。95例胃癌患者的纳入标准：①行胃癌根治术；②经术后病理学检查证实为胃癌；③术前未行放疗、化疗、生物免疫治疗或靶向治疗；④既往无其他部位的肿瘤病史；⑤具备一定的听、说、读、写能力。排除标准：①合并严重的心肝肾功能不全；②合并精神或认知功能障碍。95例胃癌患者中，男53例，女42例；年龄为34～79岁，平均年龄为（54.26±16.40）岁；组织学分化程度参照2000年世界卫生组织（WHO）分类标准[7]：低分化53例，中高分化42例；TNM分期参照2002年国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会（Union for International Cancer Control/American Joint Committee on Cancer，UICC/AJCC）指南[8]：Ⅰ～Ⅱ期43例，Ⅲ～Ⅳ期52例。另选取同期30例胃癌患者（均随机从95例胃癌患者的胃癌组织中选取）相应的癌旁正常黏膜组织（距肿瘤边缘5 cm以上），均经病理学检查证实为正常的胃黏膜组织。

1.2 免疫组织化学染色方法

所有标本均先采用10%甲醛溶液固定，常规脱水和石蜡包埋后，4 μm厚连续切片，并行常规苏木精-伊红染色和病理学检查。具体染色方法：选取8张石蜡切片进行脱蜡和抗原修复，然后分别采用3%H2O2和正常动物血清封闭50 min，封闭结束后，将其中4张切片滴入兔抗人DAB2IP单克隆抗体（稀释浓度1∶100，购于北京博奥森生物技术有限公司），4℃下孵育24 h；另外4张组织切片滴入鼠抗人β-catenin抗体（稀释浓度1∶50，购于北京中杉金桥生物技术有限公司），4℃下孵育24 h；孵育完成后磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）冲洗3次，滴加生物素标记的二抗，37℃下孵育40 min后，PBS连续冲洗3次（＞5 min）；滴加链霉卵白素和辣根酶标记生物素复合物，37℃下孵育40 min后，PBS连续冲洗3次（＞5 min）；滴加氨基联苯氮显色液，常温下显色3～5 min，并用PBS替代一抗体作为阴性对照。

1.3 染色结果判定

DAB2IP阳性染色为主要定位于细胞质，出现浅黄色至棕褐色颗粒；β-catenin阳性染色主要定位于细胞膜，出现棕褐色细小颗粒状。每张石蜡切片随机选取10个高倍视野（×400），每个视野随机计数100个细胞；采用半定量乘积法对染色结果计分。根据染色强度评分：不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；根据阳性细胞所占百分比评分：＜6%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75为4分。最终按照两项的乘积计算总分，总分≥3分为阳性，总分≤2分为阴性。

1.4 随访

主要采用微信群、电话和电子邮件的方式对患者进行随访，定期与患者预约门诊复查的时间。从患者进行胃癌根治术为事件的起点，以随访中患者死亡或不明原因的失访为终点事件。随访截止时间为2017年8月。

1.5 统计学分析

将实验室和随访数据录入Epidata 3.0软件建立胃癌数据库，并采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用 McNemarχ2检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用t检验；相关性分析采用Spearman秩相关分析；生存曲线采用Kaplan-Meier法绘制，生存时间的比较采用Breslow检验；采用Cox比例风险回归模型对胃癌患者预后的影响因素进行单因素和多因素分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DAB 2IP和 β-catenin阳性表达情况的比较

β-catenin在胃癌组织中的阳性表达率为64.21%，明显高于癌旁正常黏膜组织的36.67%，差异有统计学意义（χ2=7.083，P＜0.01）；DAB2IP在胃癌组织中的阳性表达率为49.47%，明显低于癌旁正常黏膜组织的93.33%，差异有统计学意义（χ2=16.493，P＜0.01）。（表1）

表1 不同组织中DAB 2IP和 β-catenin阳性表达情况的比较 [n（%）]

2.2 不同临床特征胃癌患者胃癌组织中DAB 2IP和 β-catenin阳性表达情况的比较

不同TNM分期、浸润深度、远处转移情况和淋巴结转移情况胃癌患者胃癌组织中DAB2IP阳性表达情况比较，差异均有统计学意义（χ2=12.943、8.255、6.281、11.533，P＜0.05）；不同年龄、性别、肿瘤最大径、组织分化程度胃癌患者胃癌组织中DAB2IP的阳性表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。不同TNM分期、淋巴结转移情况、分化程度和浸润深度胃癌患者胃癌组织中β-catenin的阳性表达情况比较，差异均有统计学意义（χ2=9.820、7.224、11.043、8.119，P＜0.05）；不同年龄、性别、肿瘤最大径和远处转移情况胃癌患者胃癌组织中β-catenin的阳性表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

2.3 94例胃癌患者预后的影响因素分析

单因素分析结果显示，DAB2IP表达（HR=0.35，95%CI：0.19～0.67）、年龄（HR=2.44，95%CI：1.15～5.14）、远处转移（HR=3.25，95%CI：1.05～10.10）、TNM分期（HR=2.35，95%CI：1.02～5.39）和β-catenin表达（HR=2.21，95%CI：1.20～4.10）可能与胃癌患者的预后有关（P＜0.05）（表3）。将上述5种有统计学意义的因素再次纳入Cox比例风险回归模型中进行多因素分析，结果显示，有远处转移和DAB2IP阴性表达是影响胃癌患者预后的独立危险因素（P＜0.01）（表4）。

2.4 胃癌组织中DAB 2IP和 β-catenin表达的相关性

47例DAB2IP阳性表达的胃癌患者的胃癌组织中，β-catenin的阳性表达率为38.30%（18/47）；48例DAB2IP阴性表达的胃癌患者的胃癌组织中，βcatenin的阳性表达率为89.58%（43/48）。β-catenin在DAB2IP阴性表达组织中的阳性表达率明显高于DAB2IP阳性组，差异有统计学意义（P＜0.01）。经Spearman相关性分析，DAB2IP和β-catenin在胃癌组织中的表达呈明显负相关（r=-0.535，P＜0.01）。（表5）

表2 不同临床特征胃癌患者胃癌组织中DAB 2IP和 β-catenin的阳性表达情况

表3 胃癌患者预后影响因素的单因素COX回归分析

表4 胃癌患者预后影响因素的多因素COX回归分析

表5 胃癌组织中DAB 2IP和 β-catenin表达的相关性（n=95）

2.5 DAB 2IP和 β-catenin表达与胃癌患者生存情况的关系

95例胃癌患者的中位随访时间为38个月（9～60个月）。47例DAB2IP阳性表达的患者中，12例（25.53%）患者死亡；48例DAB2IP阴性表达的患者中，23例（47.92%）患者死亡。DAB2IP阳性表达患者的生存时间为12～60个月，长于DAB2IP阴性表达患者的9～60个月，差异有统计学意义（χ2=4.991，P=0.025）（图1）。61例β-catenin 阳性表达的患者中，28例（45.90%）患者死亡；34例β-catenin阴性表达的患者中，7例（20.59%）患者死亡。β-catenin阴性表达患者的生存时间为9～60个月，长于阳性表达组患者的12～52个月，差异有统计学意义（χ2=4.556，P=0.033）（图2）。

图1 DAB 2IP阳性表达（n=47）和DAB 2IP阴性表达（n=48）胃癌患者的生存曲线

图2 β-catenin阳性表达（n=61）和 β-catenin阴性表达（n=34）胃癌患者的生存曲线

3 讨论

DAB2IP又称ASK1相互作用蛋白，是新发现的肿瘤抑癌基因，其定位于染色体9q33.1～q33.3上，由C2、RasGAP、PH和DUF四个结构域组成，共包含14个内含子和15个外显子，可编码967个氨基酸[9]。既往研究发现，DAB2IP能够抑制前列腺癌、结直肠癌和胃癌等多种肿瘤的发生、发展过程，并参与多种肿瘤相关信号转导过程的核心环节[3,5-6]。目前已有文献报道，DAB2IP能够介导MAER/细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路、细胞凋亡信号调节激酶 1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）-c-Jun氨基末端激酶1（c-jun N-terminal kinase 1，JNK1）通路、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路、磷酸肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也称AKT）通路及GSK-3β-β-catenin通路等参与细胞的生长、分化和凋亡[10-11]。研究证实，DAB2IP在多种肿瘤细胞中的表达均下调。Dote等[12]研究认为，胃肠道肿瘤中DAB2IP表达的下调主要与启动子5′区域的异常甲基化有关，且启动子m2a和m2b区域的甲基化状态与胃部肿瘤的发病位置有关。目前，关于DAB2IP在胃癌组织中表达情况及其与患者预后关系的报道仍较少见。本研究结果显示，DAB2IP在胃癌组织中的阳性表达率明显低于癌旁正常黏膜组织（P＜0.01）。这与王瀚等[13]研究的结果相似，其分析认为主要与胃癌组织中的DAB2IP表达受到抑制有关。另外，不同TNM分期、浸润深度、远处转移情况和淋巴结转移情况胃癌患者胃癌组织中DAB2IP表达情况比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；且随着TNM分期、浸润深度的增加，阳性表达率降低。DAB2IP阳性表达与胃癌患者预后关系的研究结果显示，DAB2IP阳性表达患者的生存时间长于DAB2IP阴性表达患者（P＜0.05）。Cox回归分析显示，远处转移和DAB2IP阴性表达是影响胃癌患者预后的独立危险因素。上述结果均提示DAB2IP对胃癌患者的诊断和预后预测具有重要的价值，有望成为今后胃癌患者疗效和预后评估的重要参考指标。

β-catenin是一种主要存在于细胞膜和细胞质中的单链多肽，主要由CTNNBl基因编码，通常被认为是WNT信号转导通路的主要组成部分[14]。在正常生理情况下，β-catenin主要被肿瘤抑制基因APC抑制而维持低水平状态。WNT信号转导通路的异常激活或APC的突变可导致细胞质内βcatenin大量积聚。既往相关研究表明，WNT/βcatenin信号转导通路可通过调控多种效应分子从而参与胃癌的发生发展、浸润和转移过程[4,15]。本研究结果显示，胃癌组织中β-catenin的阳性表达率明显高于癌旁正常黏膜组织（P＜0.01），且不同TNM分期、淋巴结转移情况、分化程度和浸润深度胃癌患者胃癌组织中β-catenin表达情况比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），这与Kaya等[16]以及陈超和姚莉敏[17]的研究结果相似。另外，本研究发现，β-catenin阴性表达患者的生存时间长于β-cateni阳性表达（P＜0.05）；单因素回归分析结果显示，βcatenin表达可能是胃癌患者预后的影响因素（HR=2.21，95%CI：1.20～4.10），上述结果均提示β-catenin也参与了胃癌的发生发展和预后过程。但是，多因素回归分析发现β-catenin表达不是影响胃癌患者预后的独立危险因素（P＞0.05），因此，关于β-catenin与胃癌患者预后的关系有待进一步深入研究。

目前，关于DAB2IP与β-catenin之间相互作用方式的研究仍较少。Xie等[5]进行的一项关于前列腺癌的研究发现，当DAB2IP正常表达时，其分子结构中的C2结构域可与蛋白磷酸酶2A和GSK-3β相结合，诱导GSK-3β活化进而导致β-catenin表达下调，主要表现为GSK-3β-β-catenin信号转导通路的阻断。而前列腺癌细胞中DAB2IP沉默导致表达下调时，β-catenin的转录活性增强，导致过多的β-catenin积聚在细胞核内，加速其在细胞质中的降解进程，诱导上皮-间充质干细胞的转化，从而增强肿瘤细胞的浸润和转移能力。Wu等[18]同样研究发现，DAB2IP能够阻断WNT/β-catenin通路，诱导抗凋亡因子Clusterin表达，增加肿瘤细胞的抗药性。本研究发现，胃癌组织中DAB2IP的阳性表达率低于癌旁正常黏膜组织，而β-catenin的阳性表达率高于癌旁正常黏膜组织（P＜0.05）。经Spearman相关性分析，二者在胃癌组织中的表达呈负相关（r=-0.535，P＜0.01），这可能提示DAB2IP也可通过GSK-3β-β-catenin信号转导通路在胃癌的发生、发展过程中起重要的作用。

综上所述，DAB2IP和β-catenin可作为胃癌诊断和预后评估的有效指标。两者在胃癌组织中的异常表达与胃癌患者的TNM分期、组织分化程度、淋巴结转移情况、远处转移情况和生存时间密切相关，且随着两者分子生物学交互作用的进一步阐明，可能为评估胃癌的生物学行为提供更多的标志物。当然，本研究仍存在不足之处，主要是纳入的样本量较小和随机误差的影响较大。因此，未来研究应进一步纳入更多的胃癌患者并进行远期生存情况的随访，同时对纳入的患者进行治疗方法或年龄的分层，以进一步证实DAB2IP和βcatenin在胃癌中的诊断和预后预测价值。