脑胶质瘤中长链非编码RNA TCONS_00008552促进放疗抵抗、侵袭转移的机制

郑杰灵 袁亚维

南方医科大学南方医院放疗科（广州510515）

胶质瘤是成人最常见的原发性颅内肿瘤，约占脑部恶性肿瘤的80%［1］，根据病理可分为低度恶性及高度恶性胶质瘤。据统计，我国胶质瘤的发病率排在第7 位，病死率排在第8 位［2］。其中，胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）在成人脑肿瘤中死亡率最高，5年生存期约5%［3］。胶质瘤的预后不仅与组织学分型相关，还与肿瘤分子病理学特征密切相关。2016年WHO 更新了中枢神经系统肿瘤的分类标准，开始引入分子诊断标准［4］。可见，胶质瘤中的分子学研究取得很大的进展。放射治疗是治疗高级别胶质瘤的常规手段，也是最有效的辅助治疗手段，可改善患者的预后，但是存在放射抵抗的患者中往往治疗效果不佳，肿瘤常出现快速进展及恶性侵袭［5］。因此，深入研究胶质瘤放疗抗性的分子机制，筛选出新的治疗或增敏靶点以达到增加胶质瘤的放疗敏感性，抑制肿瘤侵袭转移，提高放疗效果，在胶质瘤治疗研究中至关重要。

长链非编码RNA（LncRNA）的长度通常大于200 个核苷酸，不编码蛋白，其表达具有组织特异性和肿瘤类型特异性［5-7］。越来越多的研究表明，LncRNA 在转录前、转录后水平参与不同肿瘤的发生发展，如肺癌［8］、胃癌［9］、肝癌［10］、乳腺癌［11］等。其中，LncRNA在胶质瘤中发挥抑癌或促癌的功能，可作为治疗靶点以及预测预后的分子标志［12-14］，可见，筛选出与胶质瘤放疗抵抗相关的LncRNA 同样是潜在的放疗增敏靶点。但是与胶质瘤放疗抵抗或侵袭转移相关的LncRNA 的研究很少，在前期研究中，笔者进行RNA 芯片分析［15］，筛选出在胶质瘤放疗抵抗株M059K 中高表达，在敏感株M059J中低表达的LncRNA TCONS_00008552，本文拟研究其在胶质瘤的放疗抵抗、侵袭转移的功能，并进行机制的探索，以期为胶质瘤放疗抵抗的分子机制研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人胶质瘤细胞株M059K、M059J购与美国模式菌种收集中心（ATCC）。使用含10%胎牛血清（GIBCO，Australia）、0.5%丙酮酸钠（GIBCO）和0.5%非必需氨基酸（GIBCO）的DMEM-F12培养基（Gibco）进行培养，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中。

1.2 细胞照射 选择对数生长期的胶质瘤细胞进行照射，放射源为VARIAN 2300EX 直线加速器6MV X线，源皮距为100 cm，照射剂量率为5 Gy/min。

1.3 提取RNA 和逆转录 用Trizol 试剂盒（Invitrogen）按照步骤提取RNA，测浓度后用逆转录试剂盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit，TAKARA）进行逆转录并置于-20 ℃冰箱保存。

1.4 RT-PCR 使用PCR 试剂盒（SYBR®Premix Ex TaqTM kit，TAKARA）进行RT-PCR（LightCycler 480 real-time PCR system，Roche，Stockholm，Sweden），得到各组循环阈值（thresholdcycle，Ct），并采用2-△△Ct法对进行相对定量计算。

1.5 瞬时转染 按1 × 105个/孔的细胞密度把细胞接种于6 孔板中，待细胞融合度达到50%～70%时，按lipofectamin3000（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）试剂操作说明进行转染24 h 后换液并进行后续实验。

1.6 Western Blot 检测 用RIPA、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂混合物裂解细胞刮取蛋白，离心并收集上清，按照BCA 试剂盒（康为世纪）测定蛋白浓度并配平，然后经凝胶电泳、转膜、脱脂奶粉封闭后，孵育E-cadherin、Vimentin、cleaved PARP、β-actin 的一抗以及相应二抗，最后进行曝光显影。

1.7 统计学方法 统计学分析用SPSS 19.0 软件（IBM Corp，Armonk，NY）完成，采用独立样本t检验、多样本方差分析等统计方法进行验证。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA TCONS_00008552 在胶质瘤细胞株中的表达 胶质瘤细胞株M059J（DNA-PKcs 突变型）和M059K（DNA-PKcs 野生型）是在同一胶质瘤肿瘤标本中分离出来的一对细胞株，M059K 存在辐射抵抗，M059J 对辐射相对敏感（约30 倍）。以这两种细胞株作为实验模型行芯片分析，筛选出差异表达的LncRNA 和mRNA［15］。其中，LncRNA TCONS_00008552在M059K 中高表达，在M059J 中低表达。并通过RT-PCR 检测两株细胞中TCONS_00008552 在非照射和照射后的表达量。结果发现（图1），非照射或照射后（6 Gy）6、12、24 h放疗抵抗株M059K中TCONS_00008552的表达量明显高于放疗敏感株M059J（F=78.56，P＜0.000 1）。说明照射后放疗抵抗株M059K中TCONS_00008552的表达量无明显下降，提示TCONS_00008552可能与胶质瘤细胞放疗敏感性有关，TCONS_00008552 可能增加胶质瘤细胞放疗抵抗。

图1 TCONS_00008552 在照射前或照射后6、12、24 h 的表达水平（6 Gy）Fig.1 The expression of TCONS_00008552 in M059K and M059J cells

2.2 TCONS_00008552 增强胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力 在放疗抵抗株M059K 使用siRNA下调TCONS_00008552，在放疗敏感株MO59J 用TCONS_00008552 慢病毒过表达载体上调其表达。首先通过MIT 实验检测细胞的存活及增殖能力有无变化。结果发现（图2），与对照组相比，下调TCONS_00008552 后，细胞生长速度明显减慢，48 h开始两者差异有统计学意义（siRNA1：F=47.368，P=0.002；siRNA2：F=28.780，P=0.006）；上调TCONS_00008552 后，细胞生长速度明显加快，72 h两者差异有统计学意义（F=21.571，P=0.010）。初步表明TCONS_00008552 可以增强胶质瘤细胞的增殖能力。划痕实验显示（图3），划痕24 h后，下调TCONS_00008552 的M059K 细胞（43.67±8.81）%划痕愈合率较对照组（70.33 ± 9.18）%显著降低（t=2.965，P=0.041 3），提示TCONS_00008552 可促进胶质瘤细胞的迁移能力。Transwell 侵袭实验结果发现（图4），与对照组相比（272.33 ± 23.61），下调TCONS_00008552 后，M059K 穿过基底膜的细胞数量明显减少（108.33 ± 12.71，t=8.649，P=0.001 0）；与对照组相比（107.33 ± 12.28），上调TCONS_00008552 后，M059J 穿过基底膜的细胞数量明显增加（244.67±23.68，t=7.267，P=0.001 9）。说明TCONS_00008552可增加胶质瘤细胞的侵袭能力。通过Western Blot 检测上皮间质化过程（EMT）相关标志物E-钙黏蛋白（上皮标志蛋白）、Vimentin蛋白（间质标志蛋白）的表达水平。结果显示（图5），与对照组相比，在M059K干扰TCONS_00008552后。E-钙黏蛋白的表达升高、Vimentin 蛋白的表达降低。该结果显示TCONS_00008552促进胶质瘤的上皮间质化过程，提示TCONS_00008552 可通过EMT通路促进胶质瘤细胞迁移和侵袭的能力。

图2 MTT 检测干扰或过表达TCONS_00008552 对细胞增殖能力的影响Fig.2 TCONS_00008552 promotes the proliferation of glioma cells

图3 划痕实验检测TCONS_00008552对细胞迁移能力的影响Fig.3 Migration was measured by wound healing assay

图4 侵袭实验检测TCONS_00008552 对细胞侵袭能力的影响Fig.4 Invasion was measured by Transwell assay

图5 Western Blot 检测EMT 标志蛋白的变化Fig.5 TCONS_00008552 promotes the migration and invasion by EMT pathway

2.3 TCONS_00008552可减轻放疗辐射诱导的胶质瘤细胞凋亡 平板克隆形成实验结果显示（图6），在M059K 细胞中用siRNA 干扰TCONS_00008552，照射后（6 Gy）M059K 细胞的克隆形成能力明显减弱（F=81.35，P＜0.000 1）。在M059K中下调TCONS_00008552后予6 Gy照射，24 h后检测凋亡相关蛋白cleaved PARP的表达量变化情况。结果发现（图7），下调TCONS_00008552后，可明显减少cleaved PARP的表达。说明TCONS_00008552 可减轻因辐射诱导的细胞凋亡，从而促进放疗抵抗。

图6 克隆形成实验检测照射后TCONS_00008552 对细胞克隆形成能力的影响Fig.6 Clonogenesis ability was tested by plate clonality assays

图7 Western Blot 检测照射后TCONS_00008552 对凋亡相关蛋白表达的影响Fig.7 TCONS_00008552 promotes the radio-resistance by reducing apoptosis

3 讨论

胶质瘤是颅内最常见的肿瘤，具有高发病率、术后高复发性、高致死率及治疗效果不佳的特点［16］。肿瘤特征包括持续的增殖信号、生长抑制信号的钝化、细胞凋亡的逃避、潜在的无限复制性、持续的血管生长、迁移和侵袭、能量代谢重编程以及免疫逃逸等［17］。而LncRNA 参与这些肿瘤恶性生物学行为的各个过程［18-19］，在多个层面上（转录前调控、转录调控以及转录后调控等）调控基因的表达水平，并调控相关的信号通路［20］。近年来，脑胶质瘤分子标志物与病理分级、临床特征等方面的研究越来越多［21-22］，其中，LncRNA 参与胶质瘤发生发展的研究已成为目前研究胶质瘤分子机制的热点。这些研究表明LncRNA 在胶质瘤中也发挥重要的功能，如Notch1 激活可诱导LncRNA TUG1的表达促进胶质瘤干细胞自我更新和存活［14］，HOTAIR在GBM中高表达并促进肿瘤细胞增殖［23］，WIF1 通过下调LncRNA MALAT1 抑制胶质瘤细胞转移［24］。

虽然放疗在胶质瘤的治疗中发挥极其重要的作用，但LncRNA 与胶质瘤放疗敏感性相关的研究甚少，本研究以人胶质瘤放疗抵抗细胞株M059K和放疗敏感株M059J 为研究对象，筛选出新的与胶质瘤放疗抵抗相关的LncRNA TCONS_00008552。TCONS_00008552 在放疗抵抗株M059K 中高表达，在放疗敏感株M059J 中低表达。因此推测TCONS_00008552 可能与胶质瘤的放疗敏感性相关。功能实验结果表明TCONS_00008552 具有促进胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的作用，Western Blot 实验结果显示TCONS_00008552 促进胶质瘤的EMT。EMT 参与肿瘤各个过程，如肿瘤发生、肿瘤生长、侵袭和转移以及治疗抵抗［25］。在胶质瘤中，EMT促使肿瘤细胞获得干细胞特性，并促进侵袭、转移，增加放化疗抵抗［26］。说明TCONS_00008552 可通过EMT 促进胶质瘤细胞的增殖、侵袭和转移。平板克隆形成和Western Blot 实验结果表明，TCONS_00008552 可促进胶质瘤细胞的放疗抵抗，减少凋亡相关蛋白的形成，说明TCONS_00008552 可减轻放疗辐射诱导的细胞凋亡，为DNA 损伤修复提供充分条件，从而抵抗电离辐射的损伤。

综上所述，胶质瘤的恶性程度高，侵袭力强，目前仍无较好的治疗方法［27］，虽然胶质瘤的诊疗不断发展，但治疗效果没有明显改善，复发率、病死率没有明显降低。而治疗抵抗，复发和转移是胶质瘤疗效受限的主要原因，胶质瘤的治疗抵抗和转移机制研究可为胶质瘤的诊治提供基础资料。本研究发现，在放射抵抗株M059K 高表达的TCONS_00008552 对其增殖和侵袭能力具有重要的促进作用，并增加其放疗抵抗，提示该LncRNA可成为胶质瘤放疗增敏的潜在靶点。但是TCONS_00008552 在胶质瘤组织中的表达、与预后的关系等仍是未知的，本课题组将进一步研究TCONS_00008552 的下游通路，阐明其在胶质瘤中促癌及调控放疗敏感性的分子机制，并且开展体内实验以及在胶质瘤组织上进行验证，为LncRNA 相关的胶质瘤研究提供新的实验证据。