不同接种部位肿瘤进行激光共聚焦显微镜观察的可行性

朴莹 杜蓉 喻涵之

[摘要]目的 比較用小鼠腹部皮下瘤与耳部皮下瘤进行激光共聚焦显微镜原位观察药物瘤内微观行为方法的可行性与适用性，为研究原位观察肿瘤内药物渗透提供更好的方法。方法 体外培养转染绿色荧光蛋白（GFP）的小鼠乳腺癌细胞4T1（4T1-GFP）。将4T1-GFP细胞以皮下注射的方式分别接种到6～8周龄SPF级雌性ICR小鼠的腹部皮下静脉旁或耳部静脉旁。待肿瘤长到4～7 mm3大小即对小鼠实施手术，将肿瘤粘贴于载玻片上。通过尾静脉将带有Cy5荧光标记的肿瘤纳米药物注射到小鼠体内，用激光共聚焦显微镜对肿瘤药物渗透过程进行程序性图像采集。结果 耳部肿瘤细胞最适接种浓度在（2～3）×104/μl ，从第2天开始可用于成像；腹部肿瘤细胞适宜的接种浓度在（1～2）×104/μl，从第3天开始可用于成像。呈圆盘状包绕血管生长、血管分支较少的肿瘤更有利于进行肿瘤药物血管渗透成像。耳部和腹部皮下瘤模型均可较好呈现药物的渗透过程。结论 耳部与腹部皮下瘤模型在药物血管渗透效果上各有优劣，这两种模型都为肿瘤药物血管渗透过程的研究提供了新方法。

[关键词]肿瘤模型；共聚焦显微镜；活体；药物渗透

[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2019）5（c）-0004-04

Feasibility of laser confocal microscope observation of tumors at different inoculation sites

PIAO Ying DU Rong YU Han-zhi JIANG Xiang-hong

College of Chemical and Biological Engineering， Bio-nano Engineering Center， Zhejiang University， Hangzhou 310012， China

[Abstract] Objective To compare the feasibility and applicability of laser confocal microscoe for in situ observation of drug intratumoral micro-behavior in mice with abdominal subcutaneous tumors and ear subcutaneous tumors， so as to provide a better method for in situ observation of drug penetration in tumors. Methods The murine breast cancer cell line 4T1 transfected with green fluorescent protein （GFP） （4T1-GFP） was cultured in vitro. 4T1-GFP cells were subcutaneously injected into the abdominal subcutaneous vein or ear vein of female ICR mice aged 6-8 weeks. When the tumors grow to 4-7 mm3， the mice would be operated on and the tumors will be pasted on the slide. Cy5-labeled nano-drugs were injected into mice via tail vein， and programmed image acquisition was performed by confocal laser microscope. Results The optimal concentration of tumor cells was （2-3）×104/μl for ear tumor inoculation， the tumors could be used for experiments from the second day. And the optimal concentration of tumor cells was （1-2）×104/μl for abdominal subcutaneous inoculation， the tumors could be used for experiments from the third day. Tumors with less vascular branches and disc-like growth were more conducive to drug-mediated angiosmosis imaging. The model of ear and abdominal subcutaneous tumors could well show the process of drug penetration. Conclusion The models of ear and abdominal subcutaneous tumors have their own advantages and disadvantages in drug vascularization. Both models provide a new method for the study of drug vascularization in tumors.

[Key words] Tumor model； Confocal microscopy； Living body； Drug penetration

肿瘤造模是肿瘤研究的重要手段，对于深入研究人肿瘤细胞的生物学特性、细胞行为学及其基因调控具有重要意义[1-2]。肿瘤药物通过血管输送到达目的部位，从而产生疗效[3]。但这其中存在限速步骤，主要是抗肿瘤药物在肿瘤部位蓄积浓度较低，毒副作用较大是这些药物面临的主要问题[4]，与此同时，药物在肿瘤内的渗透等行为也直接影响其药效[5]。目前的实验手段大多为小鼠肿瘤建模后摘取肿瘤组织进行切片染色，观察药物在某个时间点的渗透情况[6]。小动物活体成像仪可以实时观测荧光标记药物的肿瘤内宏观浓度，但不能观察该药物在肿瘤内部微环境的微观行为[7]。而激光共聚焦显微镜的应用，实现了对药物在动物原位肿瘤模型的血管内渗透过程的实时观察，这有利于直观地动态观察整个肿瘤事件[8]。近年来，激光共聚焦显微镜技术与小动物活体成像技术的结合，已经在肿瘤的基因治疗、临床诊断、干细胞研究等方面发挥了重要作用[3，8-9]。这种方法优势明显，但也存在短板，如显微镜激发光波长较短，组织对其吸收和折射较大，使组织渗透深度有限，多数情况下只能用于浅表组织的检测[8-9]。因此，目前在肿瘤药物渗透研究中，一般只能制备皮下瘤模型来实现激光共聚焦观测。生物体不同部位具有不同的生理特性，故不同部位的皮下肿瘤模型在肿瘤药物渗透研究中有共同点和不同之处。本研究着眼于小鼠耳部皮下瘤和腹部皮下瘤两种模型，探讨用激光共聚焦显微镜观测肿瘤药物渗透过程的优劣。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

1.1.1实验动物

选取ICR雌性小鼠，5～6周龄，体重18～20 g，购于上海吉辉实验动物饲养有限公司[SCXK（沪）2017-0012]，饲养于浙江省医科院SPF级动物房中，所有实验均符合实验动物伦理要求。动物合格证号：0369083。

1.1.2 实验材料

鼠源乳腺癌细胞系4T1购自南京科佰生物科技有限公司（货号：CBP60352），稳定表达转染绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的小鼠乳腺癌细胞4T1（4T1-GFP）购自上海美轩生物科技有限公司（货号：MXC018），胎牛血清购自普诺赛生命科技有限公司（货号：164210-500），1640培养基购自Thermo公司（货号：C11875500BT），细胞培养瓶、无菌离心管等细胞实验相关耗材购自Thermo公司，激光共聚焦显微镜为日本NIKON A1型号。尾静脉注射药物为接Cy5的聚乙二醇（PEG）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

体外培养小鼠4T1-GFP肿瘤细胞，用1640培养基（含10%胎牛血清）放置于5% CO2，37 ℃细胞培养箱中培养。取对数生长期细胞，用PBS洗涤两次，0.25%胰蛋白酶消化细胞，加入含10%胎牛血清的1640培养基终止消化，用移液管吹打均匀，细胞悬液转移至15 ml无菌离心管中，900 r/min离心3 min，弃去上清，加入PBS，吹打混匀，细胞计数，调整细胞浓度。

1.2.2 肿瘤模型制备

腹腔注射阿福丁（体积分数为1.25%）麻醉小鼠，注射剂量为每千克体重12.5 ml。麻醉后即可接种肿瘤细胞至耳部和腹部皮下。

1.2.2.1耳部接种肿瘤 将细胞配制成浓度为1×104/μl、2×104/μl、3×104/μl的细胞悬液，分别注射于3只小鼠左右两只耳部皮下。接种时针头扎进两层耳部皮肤之间的血管旁，小心缓慢推入肿瘤细胞，使细胞悬液慢慢充盈到两层皮肤间隙，直至内压过大使悬液从针头处外溢时即可停止注射，可注射體积约为20 μl。

1.2.2.2腹部皮肤接种肿瘤 将浓度为1×104/μl、2×104/μl、3×104/μl的细胞悬液，分别注射于3只小鼠左右两侧腹部皮下的大血管旁，接种时针头扎进皮下而非腹腔，注意避免刺破血管，注射体积为50 μl左右。

接种过后，待小鼠麻醉消除可放回鼠笼继续饲养，待每天观察肿瘤生长情况，测量肿瘤体积大小。待肿瘤生长至合适大小便可实施成像。

1.2.3 激光共聚焦显微镜对荷瘤小鼠成像

1.2.3.1小鼠耳部肿瘤成像准备 将实验鼠实施麻醉，并对鼠耳部位用酒精棉球擦拭消毒（有毛鼠要对耳部及周边脱毛），然后将耳蜗侧铺贴于载玻片上，在鼠耳肿瘤部位与载玻片之间滴一小滴甘油（注意避免甘油产生气泡），最后用502胶将耳部边缘粘贴于载玻片上，粘贴时尽量将耳部伸展并与玻片贴合无缝。

1.2.3.2小鼠腹部皮下瘤成像准备 去除实验鼠腹部毛发并将其麻醉，将小鼠仰面放置于加热垫上。用棉球蘸碘伏对腹皮进行消毒，用眼科剪沿腹中线剪开腹皮，用镊子慢慢剥离上皮与腹腔膜之间的筋膜，避免误伤大血管，最后用502胶将剪开的腹皮边缘粘贴于载玻片上，粘贴时尽量延伸腹皮将其无缝贴合于载玻片上。

1.3 统计学方法

采用Graphpad prism 5.0对肿瘤生长情况进行统计分析，用Image J对药物在肿瘤部位的渗透程度进行统计分析。

2 结果

2.1不同接种部位成瘤情况的比较

耳部皮下接种和腹部皮下接种在接种部位形成肿瘤，成瘤率为100%，但由于部位不同，其生理环境条件不同，导致肿瘤生长速度和大小均有不同。

耳部皮肤较薄，两片皮肤之间的组织间隙很小，能够注射进去的肿瘤细胞悬浮液体积也较小，大约20 μl。为较快获得可用于成像的耳部皮下瘤模型，需要接种浓度较高的肿瘤细胞。当注射浓度为1×104/μl时，肿瘤体积增长缓慢，到第4天为4 mm3左右；2×104/μl组和3×104/μl组肿瘤体积则相对较大，在第2～4天能达到4～7 mm3大小，故更适合成像（图1A，见封四）。成瘤细胞数在裸鼠和白鼠间存在差异，白鼠免疫力强，肿瘤后期会被机体慢慢清除，需要在肿瘤快速生长期进行成像。

与耳部皮肤比较，腹部皮肤较为松弛，可以接种肿瘤细胞的体积约为50 μl。接种后肿瘤生长迅速，第3天1×104/μl组和2×104/μl组的肿瘤体积可达到5 mm3左右，能用于成像观察；而3×104/μl组接种后第1天肿瘤体积就达到5 mm3以上，之后几天体积增速较快，肿瘤血管过密，而后在机体免疫下体积变小（图1B，见封四），所以并不适合观察肿瘤血管药物的渗透过程。

2.2 肿瘤的最佳成像条件

2.2.1肿瘤大小对观察药物渗透的影响

用激光共聚焦显微镜对肿瘤血管药物渗透过程进行成像时，只能用4倍或10倍的物镜镜头，放大倍数不宜太大，否则成像模糊。肿瘤体积在3～5 mm3即可观察到肿瘤全貌以及周边血管与肿瘤相接的绝大部分或全部（图2A）；若不需要观察肿瘤全貌，肿瘤可以更大，随之肿瘤血管也更加丰富。

2.2.2瘤内血管分支的影响

在观察药物渗透情况时，以看到主血管及同一层面的肿瘤为宜，以便于观察大血管向肿瘤内部渗透的情况。肿瘤实质不宜有太多分支血管（图2A），分支血管太密则无法统计药物渗透深度。若以观察肿瘤新生血管为目的时则不必限制血管生长密度，一般>5 mm3的肿瘤其分支血管会较为密集（图2B）。

2.2.3皮下成瘤部位对渗透实验的影响

耳部肿瘤包饶正常血管生长，不存在成像时肿瘤与血管不在一个平面的问题（图2C）；但腹部接种时由于皮下组织间隙大，以及组织隔膜层数多，使得肿瘤常常游离于目标血管之外，成像时肿瘤和血管不一定处于同一层面（图2D），故不利于成像。

2.2.4肿瘤形状对成像的影响

耳部肿瘤一般由于皮肤张力与压力会呈现圆盘状生长，有利于成像（图2C）；而腹部肿瘤往往呈球状生长，在肿瘤接种后可以多次按压接种部位使其尽量扁平地生长。

2.3 鼠耳部与腹部拍摄效果对比

耳部成瘤有诸多优点，但同时也存在缺点，其中最大的问题就在于皮肤毛囊对成像的影响。毛囊在视野下呈现圆形暗区且数量多，常阻挡关键视野和部位（图3A，图4A，见封四），因此，用去毛膏去掉小鼠的毛发，或使用裸鼠，可以获得更好的成像效果（图3B，见封四），从而更好地反映药物血管渗透过程（图4A，见封四）。可以发现，随着时间延长，药物逐渐渗透入肿瘤组织深部（图4B，见封四）。腹部成像规避了毛囊干扰视野的问题，也能够较好地观察到药物渗透的过程（图5，见封四），但往往由于腹膜干扰，或肿瘤与血管的相对位置不理想，导致成像效果不一定清晰。

3 讨论

皮下移植肿瘤模型，是指将肿瘤细胞直接注射至小鼠皮下部位形成肿瘤的实验样本，是研究肿瘤生物学特性、肿瘤药物作用机理、优化肿瘤诊疗方法的重要工具[10-11]。本研究选用稳定表达绿色荧光蛋白的小鼠乳腺癌细胞株4T1-GFP，在小鼠皮下肿瘤造模没有任何免疫排斥性。该细胞株增殖迅速，能够在较短时间内获得实验模型，缩短实验周期[12]。用于活体共聚焦成像的皮下瘤模型的成功建立受诸多因素的影响[13-14]，包括肿瘤细胞的接种数目、肿瘤血管密度、肿瘤形状等因素。随着肿瘤体积增长，新生血管分枝增多且密集，导致其内部某一部位蓄积的药物由多根分支血管渗透完成，无法统计该药物的渗透能力。因此，控制肿瘤血管的密度，对于药物渗透研究至关重要[15]。此外，肿瘤包绕血管生长的方式有助于共聚焦显微镜成像时进行断层扫描，以获取“光学切片”[16]，而游离于血管之外独立生长的肿瘤在成像扫描中难以与血管聚焦于同一层面，由此可见，肿瘤与血管的相对生长位置是影响成像质量的关键点[17-18]。

经过一系列摸索，本课题组成功地将4T1-GFP移植到ICR小鼠皮下不同部位，建立了两种可用于研究肿瘤药物渗透过程的小鼠皮下瘤模型[19-21]，一种是鼠耳皮下瘤模型，另一种是腹部皮下瘤模型。两者在构建操作、成像难度、成像效果以及动物伦理等方面各有优劣。

鼠耳皮下瘤模型的优势在于：①成像前不需要手术，可直接用于成像；②肿瘤容易包绕血管生长，利于共聚焦成像；③从伦理角度来讲，这种方法减少了实验動物所遭受的痛苦，实验后死亡率大大降低，生存质量提升。与此同时，其劣势也十分明显，主要在于：①耳部毛囊在镜下清晰可见，对拍摄效果有一定程度的影响；②隔着一层耳部皮肤进行成像，导致其清晰度降低。腹部皮下瘤模型的优势：①接种操作简单；②腹部血管比耳部粗大，成瘤更快；③成像视野干净，无毛囊等结构阻挡视野。其劣势：①在大多数情况下，肿瘤未能包绕血管生长而不能清晰成像；②对实验动物损伤较大，需要手术之后成像，客观上会使死亡率上升。

本研究通过对两种皮下瘤模型建立过程中成瘤时间及特性等因素的把控，成功构建了操作简便的用于共聚焦成像的皮下瘤模型，实现了对纳米药物渗透过程的观察[22]，这个过程包含了药物从血液渗透进入肿瘤外部组织，最终在整个肿瘤部位分散开，使研究者对肿瘤药物的渗透有一个直观了解。两种皮下瘤模型的建立为肿瘤药物治疗提供了良好的动物模型及平台。但是，这种方法目前还存在一定的局限性，主要包括两方面。①我们只能观察到肿瘤外部大血管与肿瘤边界的药物渗透过程，而看不到肿瘤内部新生血管向细胞外基质甚至是肿瘤细胞的渗透过程；②目前最大视野只能拍摄到10倍物镜大小，若再提高放大倍数，会导致成像清晰度降低。有鉴于此，我们暂时尚不能实现对药物渗透肿瘤的亚细胞过程进行在体实时观察。

综上所述，本研究还有待于进一步深入探索，以期为肿瘤治疗提供更多有效的指导。

[参考文献]

[1]胡敏，汪剑锋，赖天幸.肿瘤细胞皮下接种法建立裸鼠肝癌模型的研究[J].今日药学，2016，26（6）：397-399.

[2]谭邓旭，张彩勤，赵宁宁，等.肝癌临床标本原位移植模型的建立及其影像学评估[J].实验动物科学，2018，35（3）：12-16.

[3]杨莹，胡叶，吴娜，等.肿瘤血管生成拟态在结肠癌中的研究进展[J].现代肿瘤医学，2018，26（1）：149-152.

[4]Sun Q，Zhou Z，Qiu N，et al.Rational design of cancer nano-medicine：nanoproperty integration and synchronization[J].Adv Mater，2017，29（14）：1606628.

[5]韩冬琳，亓洪昭，赵瑾，等.增强纳米药物载体肿瘤内渗透分布的研究进展[J].化学进展，2016.28（9）：1397-1405.

[6]Moiseev A，Snopova L，Kuznetsov S，et al.Pixel classification method in optical coherence tomography for tumor segmentation and its complementary usage with OCT microangiography[J].J Biophotonics，2018，11（4）：e201700072.

[7]胡向丹，肖静，翟秋丽，等.基于活体成像技术的裸鼠卵巢癌休眠模型的建立[J].广东医学，2017，38（9）：1305-1308.

[8]张文豪，李建军，杨德刚，等.双光子显微镜在小动物活体光学成像中的研究进展[J].中国康复理论与实践，2017， 23（1）：37-41.

[9]Fitoussi V，Faye N，Chamming′s F，et al.In vivo imaging of tumor angiogenesis using fluorescence confocal videomicroscopy[J].J Vis Exp，2013，（79）：e50347.

[10]戴玥，陈家欢，邵向前，等.两种啮齿动物胶质瘤模型的构建和比较[J].杭州师范大学学报（自然科学版），2016， 15（5）：479-483.

[11]汪柳旭，朱凤军，廖建湘，等.U87胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型建立[J].中国实用神经疾病杂志，2018，21（3）：239-242.

[12]严丽，李莉，郝芳，等.BALB/c小鼠乳腺癌4T1细胞株移植模型的建立[J].中国免疫学杂志，2014，30（6）：794-796.

[13]容佩荣，刘凤莉，朱倩，等.癌毒清对肝癌模型小鼠肿瘤组织病理及微血管密度的影响[J].河南中医，2019，39（1）：53-56.

[14]杨杉，徐程，姚静.抗肿瘤血管生成治疗的纳米递送策略[J].中国药科大学学报，2019，50（1）：11-18.

[15]于德浩，胡斌，徐晋洋，等.甲状腺乳头状微小癌中微淋巴管密度和微血管密度的检测及意义[J].贵州医科大学学报，2018，43（9）：1033-1037.

[16]唐永红，邢达，高双荣，等.利用激光掃描共聚焦显微镜的肿瘤血管在体成像研究[J].激光生物学报，2003，12（3）：184-186+194.

[17]许佳玲，罗剑文，龙钊，等.ZEISSLSM780激光扫描共聚焦显微镜的三维成像及分析[J].电子显微学报，2018，37（1）：71-76.

[18]王娟娟，魏学红.激光共聚焦显微技术在共定位应用中的常见问题[J].影像科学与光化学，2018，36（6）：532-538.

[19]马雪曼，于明薇，张甘霖，等.小鼠Lewis肺癌不同部位皮下移植瘤模型的比较[J].中国实验动物学报，2017，25（4）：386-390.

[20]李潇，王昀，陈韬亮，等.靶向成纤维细胞生长因子受体抑制胶质瘤中血管生成拟态的生成[J].实用医学杂志，2017，33（11）：1735-1738.

[21]肖开提·阿不都哈德尔，王理，张文斌，等.结肠癌皮下移植瘤模型方法的优化[J].新疆医科大学学报，2015，38（5）：586-589.

[22]汤婷婷，刘华钢，梁燕，等.肿瘤多药耐药模型建立方法的应用进展[J].山东医药，2018，58（7）：96-98.

（收稿日期：2019-03-12 本文编辑：许俊琴）