牛樟芝菌种培养基质筛选

蒋忠成 郑 元 张 颖 杨宇明 王 娟 陈 翔



牛樟芝菌种培养基质筛选

蒋忠成1郑 元1张 颖2*杨宇明3王 娟4陈 翔5

（1. 西南林业大学林学院，云南 昆明 650224；2. 西南林业大学云南省森林灾害预警与控制重点实验室，云南 昆明 650224；3. 云南省林业科学院，云南 昆明 650201；4. 西南林业大学西南绿色发展研究院， 云南 昆明 650224；5. 福建省林业科技试验中心，福建 南靖 353600）

采用固体恒温暗培养的方式，通过改变培养基的营养基质，探究牛樟芝菌丝体对不同碳氮源的效应。结果为：蛋白胨和果糖是菌丝生长的最适氮源和碳源，最优的种源是2号，3、5和6号次之。不同碳氮源分别在10～15天、15～20天平均生长速度最快。对比发现，牛樟芝菌丝体在葡萄糖、胡萝卜基质上生长最快的是10～15天。在胡萝卜、果糖基质上的菌落颜色最鲜艳。

牛樟芝；氮源；碳源；种源；筛选

牛樟芝（(M. Zang & C.H. Su) Sheng H. Wu, Z.H. Yu, Y.C. Dai & C.H. Su）隶属担子菌门、层菌纲、多孔菌目、多孔菌科、台芝属，寄生于牛樟树上，是一种珍稀药用真菌，原产于中国台湾[1]，大陆无自然分布[2]。牛樟芝含有多种生理活性物质，其中β- D-葡聚糖和三萜类化合物的活性强，同时还含有超氧歧化酶和核酸类等，具有抗肿瘤、增加免疫能力、抗细菌、抗病毒、抗过敏、抗高血压、降血糖、降胆固醇、抑制血小板凝集及保护肝脏等药用功效[3-7]。牛樟芝在台湾被公认为解毒剂，且效果非常明显[8]。

由于野生牛樟芝数量稀少，药用价值很高，在台湾民间有“森林中的红宝石”之称[9]。对牛樟芝的研究已有许多相关的报道[10-13]。本文旨在筛选牛樟芝菌种的保存和培养条件，对比其菌丝在不同时段的生长速度，挑选适合牛樟芝菌丝体生长的培养基质和具有生长优势的菌株。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验选用7个牛樟芝瓶装菌株，其中来自台湾嘉义县阿里山达邦地区2个（编号1、2），桃源县的南庄地区2个（编号3、4），花莲县中央山脉的秀姑峦地区2个（编号5、6）、屏东县的关山地区1个（编号7）。

使用试剂有甘露糖、麦芽浸粉、维生素B1、牛肉浸粉、酪蛋白胨、木糖、果糖、木糖醇、鱼蛋白胨、酵母粉、牛肉蛋白胨、硫酸镁、硝酸钠、琼脂等。

1.2 试验方法

（1）菌种的保存活化。活化培养基：葡萄糖20 g/ L、硫酸镁0.5 g/ L、马铃薯200 g/L（煮汁）、酵母粉5 g/L、磷酸二氢钾1 g/L 、维生素B10.1 g/L、琼脂16 g/L，pH自然。装瓶、灭菌、倒皿及接种后，在黑暗条件下25 ℃恒温培养，定期观察至菌丝长满瓶。

（2）培养基筛选。①两个基础（对照）培养基。1号培养基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨6 g/L、琼脂16 g/L，pH 自然。2号培养基：胡萝卜200 g/L（煮汁）、葡萄糖20 g/L、琼脂16 g/L，pH自然。②不同氮源培养基。用等量的7种氮源（硫酸铵、硝酸钠、酪蛋白胨、麦芽浸粉、酵母浸粉、牛肉浸粉、鱼蛋白胨）分别代替1号培养基中的蛋白胨[14]，配制成不同氮源的培养基处理，每处理设3个重复。③不同碳源培养基。用等量的其他5种碳源（麦芽糖、甘露醇、果糖、木糖、木糖醇）分别代替2号培养基中的葡萄糖[14]，配制成不同碳源的培养基，每处理设3个重复。

（3）培养方法和观测指标。在无菌条件下采用平板培养法进行培养[15]，将长满牛樟芝菌丝的平板和所要筛选的培养基放入超净工作台进行紫外线消毒处理后接种，然后恒温暗培养。每隔2天观测菌丝的生长情况和菌落特征，从接种的第2天开始测量菌落的生长直径，30天后评价菌落长势。菌落长势的评级标准=（菌丝密度×菌落颜色）÷2[16]。菌丝密度以“+”的个数表示；菌丝颜色偏红程度以“☆”的个数表示。

菌丝生长指数=菌丝生长速度（mm/d）×菌落长势；不同培养基质对菌丝生长的影响用菌丝生长指数表示[17，18]。

2 结果与分析

2.1 不同氮源的效应

牛樟芝菌丝在8种培养基质中均可生长，且经差异显著性检验各处理间菌丝生长的差异均为极显著。菌落直径，以蛋白胨培养基较大，达64.38 mm，高出其他氮源基质7.8%～33.9%；菌落颜色评级为4☆，菌丝密度4+，长势评级为4。硝酸钠培养基菌落直径较小，为42.57 mm，但菌丝密度和菌落颜色分别为4+和5☆，长势评级也为4。长势评级较低的是鱼蛋白胨基质，仅为2。蛋白胨基质菌丝生长快速，平均生长速度为1.78 mm/d，比其他7种基质高9.6%～41.0%。表明蛋白胨培养基为最适宜牛樟芝菌丝体生长的氮源，其生长指数达到7.12，比其他氮源高出9.6%～65.4%。

由表2可知，2号菌株在蛋白胨和硝酸钠，3号菌株在酵母浸粉，6号菌株在酪蛋白胨和酵母浸粉基质上的生长速度较快，平均达到2.63 mm/d。硫酸铵、硝酸钠和鱼蛋白胨培养基4号菌株菌丝不生长，硝酸钠培养基对7号菌株也无生长效应。1号菌株适宜氮源为蛋白胨，菌丝生长速度为2.03 mm/d，明显高于其他5种基质；2号菌株适宜氮源是蛋白胨和硝酸钠；3号菌株适宜酵母浸粉；试验所使用的8种氮源对4号菌株的生长促进作用均较小；5号菌株适宜氮源为鱼蛋白胨；6号菌株适宜氮源为酵母浸粉和酪蛋白胨；7号菌株适宜氮源为酪蛋白胨基质。

图1为不同氮源基质7个牛樟芝菌株各时段的平均生长速度，可看出，15～20 d，牛樟芝菌株菌丝平均生长速度以酵母浸粉基质最高，为5.62 mm/d，较同时段内其他氮源基质高18.5%～70.3%。1～5 d各基质菌丝生长均较慢；5～10 d蛋白胨培养基菌丝生长速度（3.14 mm/d）显著高出其他7种氮源51.6%～84.7%；10～15 d以酪蛋白胨基质菌丝生长速度较快，为3.00 mm/d；20～25 d以麦芽浸粉培养基菌丝生长较快，为3.44 mm/d；25～30 d菌丝生长急剧变慢。硫酸铵、牛肉浸粉、麦芽浸粉和鱼蛋白胨基质20～25 d时菌丝体生长最快；硝酸钠、酪蛋白胨和酵母浸粉基质15～20 d菌丝生长较快。

表1 不同氮源基质牛樟芝菌丝体的生长表现

注：①“+”越多，密度越高；“☆”越多，颜色越深；菌落长势评级数值越高，表示长势越好，表3同。②菌丝生长速度，各处理间呈极显著差异，表3同。

表2 不同氮源与各牛樟芝菌株菌丝生长的关系（单位：mm/d）

图1 不同氮源基质不同时段牛樟芝菌丝的生长速度比较

表3 不同碳源基质牛樟芝菌丝的生长情况

2.2 不同碳源的效应

用胡萝卜提取物和不同碳源培养牛樟芝，分析测得的数据，获得牛樟芝菌丝体生长指标的变化。

从表3可以看出，6种不同碳源的培养基对牛樟芝的生长均有一定的促进作用。菌丝密度和菌落颜色，以葡萄糖、麦芽糖、果糖和木糖基质较好，分别为5+和5☆；甘露糖和木糖醇次之，分别为4+和3☆。菌落直径以果糖较大，达81.62 mm；木糖醇较小，为76 mm。菌丝体生长速度果糖基质为2.35 mm/d，高于其他6种碳源。综合表1、3可知，牛樟芝菌丝生长受碳源的影响大于氮源。

生长指数方面，葡萄糖、木糖和麦芽糖相差很小，分别为10.33、10.29和10.39；木糖醇基质较低，为7.58；果糖基质较高，达10.59（表3）。故果糖是最适宜牛樟芝菌丝生长的碳源。

图2 不同碳源基质各牛樟芝菌株菌丝生长速度比较

6种碳源对牛樟芝菌丝体的生长均有促进作用但效果有明显差异（图2）。1号菌株适宜碳源为果糖；在不同基质中2号菌株的平均生长速度均较快，为2.63 mm/d；3号菌株适宜碳源为葡萄糖、果糖、木糖和木糖醇4种，平均生长速度较快；6种碳源对4号菌株生长促进作用均小；麦芽糖、果糖和木糖3种基质对5号菌株生长的促进作用较好；葡萄糖、麦芽糖、果糖和木糖4种基质对6号菌株生长促进作用较大；7号菌株适宜麦芽糖基质。综上可知，2号菌株最佳，在不同碳源基质上的平均生长速度均最快，其次是3、5和6号，4号较差。

图3为不同碳源基质7个牛樟芝菌株各时段的平均生长速度，可以看出，10～15 d菌丝平均生长速度最高的是葡萄糖基质（8.08 mm/d），比同时段其他培养基高出17.0%～46.5%；25～30 d葡萄糖基质平均生长速度仅0.03 mm/d，生长几乎停滞。1～10 d和20～25 d甘露糖基质菌丝生长较快；15～20 d生长最快的是麦芽糖，平均生长速度4.32 mm/d，比同时段其他培养基高出12.3%～69.4%。25～30 d果糖基质菌丝体生长快；15～20 d是麦芽糖基质菌丝生长速度快；10～15 d甘露糖基质对牛樟芝菌丝体生长的促进作用最好。

图3 不同碳源基质不同时段牛樟芝菌丝的生长速度比较

3 结论与讨论

综合菌落长势、生长速度和生长指数各项指标，以蛋白胨为氮源，采用蛋白胨、葡萄糖基质对生长促进作用明显优于其他几种氮源，菌丝体平均生长速度可达1.78 mm/d。菌落直径64.38 mm，长势评分达4分，菌落大多偏红，少数淡黄色或白色。

以果糖为碳源，采用胡萝卜提取物、果糖基质培养，对菌丝体生长的促进作用明显优于其他几种碳源，菌落直径81.62 mm，平均生长速度达2.35 mm/ d，长速最快的时间段是10～15 d，达到4.42 mm/ d，生长指数最大，为10.59，且菌丝红色，与野生牛樟芝的颜色相近。

由此判定，不同的碳氮源基质不仅对牛樟芝菌丝生长效应具有显著影响，还会对牛樟芝菌丝体合成的物质造成颜色的差异。所以想要获得颜色接近牛樟芝子实体且生长速度快的菌丝体，适宜选择的氮源和碳源分别是胡萝卜提取物和果糖。

比较牛樟芝不同菌株在基质上菌丝体的密度、颜色和平均生长速度，2号菌株是最优种源，其在不同基质上的生长能力都很强，平均生长速度达到2.63 mm/d，且菌丝密度和颜色均优，3、5和6号次之。

本研究所得最佳氮源是蛋白胨，与前人的研究报道最佳氮源是牛肉浸粉[16]有一定差异，从菌落生长速度来看，本研究的结果明显快于前人研究的生长速度（1.78 mm/d＞1.47 mm/d）[19]。可能的原因是不同来源不同生长时期不同菌株的菌丝体对碳氮源的利用存在差异，导致牛樟芝在不同碳氮源培养基上生长形态和生长速度出现差异。结合牛樟芝菌丝体在不同时间段的生长特点，其延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期各为1～5 d、10～15 d、15～25 d和25 d后。

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Screeningculture medium of

Jiang Zhongcheng1Zheng Yuan1Zhang Ying2*Yang Yuming3Wang Juan4Chen Xiang5

(1. College of Forest, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China; 2. Key Laboratory of Forest Disaster Warning and Control in Yunnan Province, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China; 3. Yunnan Academy of Forestry, Kunming 650201, China; 4. Southwest Green Development Research Institute, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China; 5. Forestry Science and Technology Test Center in Fujian, Nanjing 353600, China)

In this research, different nitrogen and carbon sources were used to culture myceliumofon solid constant temperature condition, for explore the effects of mediums on the growth of mycelium, and the growth status of the mycelium were regularly observed. The results showed that the optimal nitrogen and carbon sources for the growth of mycelium ofwere peptones and fructose. The best strain is No. 2, No. 3, 5and 6 came second. The average maximum growth rate of different carbon and nitrogen sources were 10～15d or 15～20d after inoculation, respectively. By comparing the average growth rate of each nitrogen and carbon source at different periods, it was found that mycelium grew fastest in the culture medium with carrot extract as the nitrogen source and glucose as the carbon source. When carrot extract was taken as nitrogen source and fructose as carbon source, the colony color was redder, which was the closest to the wild fruitbody color of. The results can be used to estimate the growth rate of,strains expanding propagation, liquid fermentation and wood inoculation.

; the best source; strain screening

S567.3+1

B

2095-0934（2019）03-199-06

云南省科技计划项目“牛樟树、牛樟芝优质种质资源及其培育关键技术引进”（2015IA004），西南林业大学科研项目“牛樟树、牛樟芝重要功效成分生理代谢”（2176062），云南省博士后定向培养资助

蒋忠成（1994—），男，云南人，主要从事食药用真菌研究。

张颖（1978—），女，云南人，讲师，主要从事大型真菌多样性研究，E-mail：yingb.zhang@swfu.edu.cn。