模拟高原低压低氧环境对大鼠心脏结构和功能影响*

冯振龙,赵 彤,成 祥,朱玲玲,赵永岐△,施 冰

(1.安徽医科大学陆军总医院临床学院，北京 100700；2.军事医学研究院军事认知与脑科学研究所，北京 100850；3.陆军总医院干部病房一科，北京 100700)

高原地区具有气温低、湿度低、温差大、紫外线辐射强等特点[1]，其中低压低氧是其最主要的特征[2]。暴露于高原低压低氧环境时，心脏对低氧十分敏感。由于氧的供应稳态失衡以及其他因素的影响，心血管系统可发生损伤[3]，导致心脏结构和功能异常[4]。随着海拔高度的上升，心肌组织损伤逐渐加重。目前用于高原低压低氧心肌损伤研究的动物实验，大多数学者采用高原现场试验方法[5]。虽然其可以真实再现高原低压低氧环境，但是受到交通、地域等诸多因素限制，需要花费较多的人力、物力成本才能完成实验，并且影响实验结果的可重复性。本实验基于大型多因素复合环境模拟实验舱，模拟海拔7 000 m高原环境，观察高原低压低氧环境下大鼠心脏结构和功能变化，以期建立一个稳定可靠的高原低压低氧环境下心肌损伤的动物模型，为探讨高原低压低氧环境下心肌损伤发生机制、防治措施等研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

多因素复合环境模拟医学科学实验舱，贵州风雷航空军械有限责任公司；小动物超声仪，Vevo770 ultrasound system，Visual Sonics Inc，Toronto Canada；SP2006动物心电图解析系统，北京软隆生物技术有限公司；全血细胞分析仪，日本希森美康XT-2000i；小动物无创脉搏血氧仪MouseOx，STARR Life Sciences Corp.；全自动生化分析仪罗氏Cobas8000；光学显微镜，OLympus BH；罗氏原装生化试剂，10%多聚甲醛。

1.2 实验动物

SPF级SD大鼠96只，体质量(200±20)g，雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。许可证号SCXK(京)2016-0006。所有动物实验均通过军事医学研究院伦理委员会审核。

1.3 实验动物分组

采用随机数字表法将96只SD大鼠按照4个时间点随机分为高原低压低氧3 d组、7 d组、14 d组和28 d组(简称低氧组)，每组再设同时间点的常压常氧对照组(简称对照组)，每组12只。

1.4 实验方法

实验舱参数设定：模拟海拔高度7 000 m，升降速度10 m/s，新风量102.5 m3/h,舱内压力39.1 kpa，舱内氧气压力9.022 kpa，温度24.9℃，湿度23.4%RH。低氧组大鼠放置在动物实验舱内，保证食物和饮用水。实验舱运行时间23 h/d，控制昼夜比大约12 h∶12 h。每天早上8:00～9:00开舱更换垫料、补充食物和饮用水。对照组动物置于动物实验舱外，除了低压低氧外，其他处理条件与低氧组动物一致。分别在相应的时间点开舱取出大鼠，称体质量、测量动脉血氧饱和度后麻醉，进行心脏超声和心电图检查。完成上述检查后左心室取血，进行血常规和血生化等检查。开胸、完整摘取心脏后生理盐水冲洗干净，用滤纸吸干水分后，10%多聚甲醛固定。进行组织HE染色和病理分析。

1.5 大鼠超声心动图检查

各组大鼠出仓当日立刻行心脏超声检查。2% 戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉后，胸前剃毛，仰卧固定。将小动物超声仪的超声探头(频率17.5 MHz)置于大鼠胸骨前，显示左室短轴切面。于乳头肌水平，应用M超声记录左心室运动曲线，分别测量舒张末期左室前壁厚度(left ventricular end-diastolic anterior wall thickness，LVAWD)、舒张末期左心室后壁厚度(left ventricular end-diastolic posterior wall thickness，LVPWD)、左室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter,LVIDD)和收缩末期内径(left ventricular internal dimension systole,LVIDS)。计算左心室质量(left ventricular mass，LVMass)、左室短轴缩短率(fractional shortening of left ventricle，FS)、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction，EF)、肺静脉峰值流速(PV peak velocity)和肺静脉峰值压差(PV peak gradient)。

1.6 大鼠心电图检查

利用sp2006动物心电图解析系统进行心电图检查。将电极插入到麻醉后大鼠的四肢皮下，电极位置参照人体心电图的相应部位。

1.7 大鼠血液生化检查

左心室取血1 ml置于EDTA抗凝管中，利用全血细胞分析仪检测红细胞计数(red blood cell,RBC)、血红蛋白(hemoglobin,HGB)、红细胞分布宽度(red blood cell distribution width,RDW)、血小板(platelet count,PLT)计数等。左心室取血2 ml置于促凝管中离心(3 000 g，5 min)，吸取血清，利用罗氏全自动血液生化分析仪Cobas8000检测肌酸激酶(creatine kinase,CK)和肌酐(creatinine,CR)等生化参数。

1.8 大鼠心脏组织病理

大鼠处死后摘取心脏，生理盐水冲洗干净，10%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋。连续切片，厚度为4 μm，HE染色，镜下观察左心室心肌组织病理变化情况。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 低压低氧对大鼠体质量、活动情况与动脉血氧饱和度的影响

低氧组大鼠体质量在进舱后3 d时明显下降，第4日始体质量开始增长，但是增长速度与对照组相比较缓慢。动脉血氧饱和度于低氧14 d和28 d 显著降低(表1)。低氧组大鼠进仓后活动减少，饮食饮水下降，精神萎靡，昏睡。口鼻及四肢皮肤粘膜变紫，呼吸频率和心率明显增快。3～7 d后大鼠活动逐渐增多，饮食饮水增加，出现相互撕咬、兴奋状态。

2.2 低压低氧对大鼠心脏结构和功能的影响

动物超声仪可清晰地显示大鼠左心室结构，并且可以获得满意的M超左室运动曲线(图1)。随着低氧暴露时间延长，大鼠心脏结构和功能出现下述变化：(1)左心室舒张末期前壁(LVAWD)及舒张末期后壁(LVPWD)增厚。左心室舒张末期直径(LVIDD)及收缩末期直径(LVIDS)变小，28 d最为明显。(2)左心室射血分数(EF%)、左心室短轴缩短率(FS%)、肺静脉峰值流速及肺静脉峰值压差在低压低氧3～7 d逐渐下降，14～28 d逐渐恢复正常，7 d下降最为明显。(3)左心室质量(LVMass)逐渐增加，28 d最为显著(表2)。

Fig.1Motion curve of papillary muscle by left ventricular short-axis in M-mode ultrasonic

A：Control group(28 d)；B：Hypoxic group(28 d)

Tab. 1 Physiological parameters of rats at different time points of hypobaric n=12)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Tab. 2 Echocardiography parameters of rats at different time points of hypobaric n=12)

LVAWD:Left ventricular end-diastolic anterior wall thickness;LVPWD:Left ventricular end-diastolic posterior wall thickness;LVIDD:Left ventricular end-diastolic diameter;LVIDS:Left ventricular internal dimension systole;LVMass:Left ventricular mass;EF%:Left ventricular ejection fraction;FS%:Fractional shortening of left ventricle;PV peak velocity:Pulmonary vein peak velocity;PV peak gradient:Pulmonary vein peak gradient
*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.3 低压低氧对大鼠心电图的影响

随着低氧时间延长，大鼠心电图QRS及QT间期逐渐增宽，14 d及28 d最为显著。ST段逐渐下移，后期逐渐恢复，7 d及14 d下移显著。R波振幅逐渐降低，7 d，14 d及28 d降低明显(表3)

2.4 低压低氧对大鼠血常规和血生化指标的影响

低氧组大鼠红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞分布宽度(RDW)均明显增加；血小板计数(PLT)下降，14 d及28 d最为明显。肌酸激酶(CK)、肌酐(CR)都有增加趋势，各低氧组大鼠血肌酸激酶(CK)变化无统计学意义。低氧14 d及28 d大鼠血肌酐(CR)变化有显著统计学意义(表4)。

2.5 低压低氧对大鼠心脏组织形态学的影响

HE结果显示，对照组大鼠心肌细胞界限清楚。可见肌原纤维和横纹，胞核清晰。肌浆未见变性和坏死。心肌细胞间毛细血管管腔内有红细胞，心内膜平滑。低氧3 d可见心肌灶状变性和坏死，伴有炎性细胞灶状浸润和成纤维细胞增生。肌浆凝聚，横纹不清。低氧7 d心肌粗细不均，间质增宽，血管扩张。心肌细胞个别可见断裂、肿胀。肌浆凝聚、红染，横纹不清。低氧14 d心肌细胞排列紊乱、稀疏，间质增宽，血管扩张。心肌细胞可见断裂、肿胀，肌浆凝聚、红染，横纹不清。心肌间质成纤维细胞增生明显，并有胶原纤维排列。心内膜下成片炎细胞浸润，成纤维细胞和胶原纤维增生。低氧28 d心肌细胞排列明显稀疏，间质增宽。血管扩张，心肌间质成纤维细胞增生明显。部分区域心肌间质出血明显，心肌细胞胞核减少(图2)。

3 讨论

超声心动图是临床评价心脏结构和功能的常用方法。左心室射血分数(EF)和短轴缩率(FS)是评价左心室收缩功能的两个最常用指标。本研究发现，急进高原环境后3 d大鼠EF和FS均低于对照组，提示大鼠左心室收缩功能已经出现损伤。进入高原后7 d，EF和FS较3 d时下降更显著，提示左心室收缩功能受损进行性加重。进入高原后14 d和28 d，大鼠EF和FS均高于对照组，提示左心室收缩功能恢复正常。分析其原因，可能与高原低压低氧环境使交感神经兴奋性增强、肾素血管紧张素-醛固酮系统激活[6]。心率加快，外周血管阻力增加。左心室收缩做功增多，心肌耗氧量增多。心脏舒张末存留在动脉中的血量增多、舒张压升高，导致急性暴露于高海拔环境的大鼠左心室收缩功能减低。随着低压低氧时间延长，在等长机制作用下，左心室发挥了代偿功能，使低压低氧14 d和28 d组大鼠左心室收缩功能增强，EF和FS均较3 d和7 d组升高。然而部分学者研究发现，高原低压低氧对心脏的影响可表现为左室收缩功能轻度增高[7,8]。原因可能系低氧作用于颈动脉体导致交感神经兴奋性提高，通过CAMP信号通路激活细胞膜L型钙通道，增加钙离子内流，使心肌收缩能力增强[9]。

PV peak velocity和PV peak gradient 是反映左心室舒张功能的常用参数。这两个参数数值在低氧组均低于对应的对照组，提示持续高原低氧环境造成左心室舒张功能受损。其原因可能是外周血管阻力增加，左心室舒张末期容积增加以及肺循环高压和淤血导致左心室顺应性减退和充盈障碍。高原低氧不仅导致心脏功能发生变化，也可导致结构发生变化。本实验研究中超声心动图结果提示，各低氧组大鼠左心室舒张末内径和收缩末内径均小于对照组。左心室前壁和后壁厚度均大于对照组。推测大鼠心脏结构变化系低氧对心肌细胞的直接损伤所致。

Tab. 3 Electrocardiogram parameters of rats at different time points of hypobaric n=12)

QRS:QRS interval;QT:QT interval;ST:ST-segment;R:R wave amplitude
*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Tab. 4 Blood routine and biochemical parameters of rats at different time points of hypobaric n=12)

RBC:Red blood cell;HGB:Hemoglobin;RDW:Red blood cell distribution width;PLT:Platelet count;CK:Creatine kinase;CR:Creatinine
*P<0.05,**P<0.01vscontrol

高原低压低氧对心脏电生理异常与心脏结构和功能改变密切相关。本研究中心电图提示，与对照组相比，随着高原低氧时间延长，低氧组大鼠肢体导联R波幅度逐渐下降，ST段发生改变，QRS及Q-T间期延长。与暴露在高原低氧环境下青年健康男性心电图的改变一致。提示高原低氧环境下,心肌能量供应不足,导致心肌去极和复极过程延长[10，11]。低氧是影响红细胞和血色素水平变化的主要因素。本研究中大鼠血常规提示，低氧各组RBC、HGB、RDW明显增高，PLT下降。考虑红细胞增多系机体对高原低氧的一种代偿性变化。通过增加循环血液内红细胞数量来提高运氧能力，减轻机体缺氧状态。但是红细胞和血红蛋白过度增高易导致血液浓度和黏滞度增加[12]，血流缓慢，循环受阻，心脏做功增多。这也是导致高原低氧环境下心肌损伤的一个主要原因。

本实验通过对低氧组大鼠心肌组织HE染色，直观地观察到低氧3 d 和低氧7 d 心肌细胞水肿、肌浆凝聚、横纹不清、排列紊乱、心肌灶状变性和坏死伴有炎性细胞浸润、钙盐沉积、心肌纤维变性断裂等病理变化较为显著。低氧14 d 和低氧28 d 大鼠心肌细胞肥大、成纤维细胞和胶原纤维细胞增生等病理改变较为显著。提示急进高原一周内，心肌组织病理变化以水肿、炎性细胞浸润为主要表现，一周后以心肌细胞肥大，胶原纤维增生等代偿性修复为主要表现。

综上所述，本实验较好地模拟了急进高原后大鼠心脏结构和功能的动态变化过程。发现急进高原一周，心脏结构和功能即可发生损伤性改变，一周后心肌出现代偿性修复。急进高原后一周可能是进入高原习服期的一个关键时间点。本研究实验过程简便易行，在平原地区即能较好的完成整个实验，可重复性好，所得到的实验数据可以应用于高原低压低氧环境下心肌损伤的后续研究中。

致谢：感谢陆应麟研究员为本文提供的病理学分析。