利用GEO在线数据构建脑胶质母细胞瘤ceRNA网络

王 蕾 马佳康 马 军 阎东明 周 博 邢仪通 李丹丹

1)郑州大学第二附属医院放射科，河南 郑州 450003 2)郑州大学第二附属医院肿瘤科，河南 郑州 450003 3)郑州大学消化疾病研究所，河南 郑州 450003 4)郑州大学第一附属医院神经外科，河南 郑州 450052

脑胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)是星形胶质细胞瘤的一种，根据2016版WHO神经系统肿瘤分类，属于脑胶质瘤中的Ⅳ级，占星形胶质细胞瘤的50%～60%，多发于男性。其高度恶性，预后极差，主要治疗方法是手术切除，辅助放化疗，5 a生存率仅5%[1-6]。

通过高通量测序和质谱等技术进行分子特征的分析，已大大提高了对其发病机制认识。过去的主要研究集中于编码蛋白的基因，近几年发现，非编码的RNA，包括长链非编码RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)等，尽管不编码蛋白质或仅编码一些小肽，但仍然在机体生理功能调控和病理发生过程中起重要作用[7-8]。miRNA通过结合mRNA调控其表达，lncRNA通过竞争吸附miRNA抑制后者的功能，这种调控机制称为竞争内源性RNA调控(ceRNA)，是近几年研究的热点[9-10]。但GBM的ceRNA调控机制仍未完全阐明[10-13]。本文对在线数据库中含有正常脑组织和GBM组织的转录组芯片数据进行重新分析，并构建ceRNA网络，为研究GBM的发病机制奠定基础。

1 资料与方法

1．1数据下载和差异基因筛选GEO(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)数据库中，Dataset GSE103229是GBM的mRNA、lncRNA和miRNA表达的芯片数据，含正常脑组织5例，GBM 5例。下载基因表达数据和芯片平台文件，用perl语言进行基因注释，用R语言的“limma”包筛选差异基因，筛选条件：基因差异2倍以上，即logFC>1，且P<0.05。

1．2ceRNA网络构建具体方法参见文献[14]。将差异lncRNA、miRNA在miRcode数据库中进行配对。利用starBase(http：//starbase.sysu.edu.cn/)在线软件对筛选出的差异miRNA进行靶基因预测(利用miRDB、miRTarBase、TargetScan数据库)，得到lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA调控网络，利用Cytoscape v3.5.1软件进行可视化，制作出ceRNA网络图。

2 结果

2．1差异转录组芯片分析按差异倍数的对数logFC>1以及P<0.05的标准，比较癌组织和正常组织的表达量，分别得到差异的lncRNA 1 326个，癌组织中上调743个，下调583个；差异mRNA 3 743个，癌组织中上调1 865个，下调1 878个；差异miRNA 33个，上调9个，下调24个。前10个差异表达的基因见表1。

2．2差异基因ceRNA网络构建通过靶基因分析，构建了GBM的ceRNA网络，miR-124、miR-128、miR-138和miR-193b是重要的节点基因，miR-124互相作用的lncRNA和mRNA最多，见图1。

表1 前10位差异表达的基因

图1 利用GSE GSE103229胶质母细胞瘤差异基因构建ceRNA，绿色表示下调，红色表示上调；三角形表示miRNA，长方形为mRNA，菱形为lncRNAFigure 1 Construction of ceRNA using GSE GSE103229 glioblastoma differential gene，green indicates down-regulation，red indicates up-regulation；triangle indicates miRNA，rectangle is mRNA，and rhomboid is lncRNA

3 讨论

随着肿瘤分子机制的深入研究，肿瘤的诊断和靶向治疗有了迅速突破，新的诊断标志物、小分子靶向药以及免疫检查点抑制剂的出现，明显提高了肿瘤的治疗效果和预后。但对于一些恶性程度高、特殊病理类型的肿瘤，分子特征方面的研究仍然不足[15-18]。

GBM发病率相对较低，但恶性程度高，缺乏有效的早期诊断标志物，晚期患者预后很差，亟需加强对其分子机制的研究，寻找更为有效的诊断指标和治疗靶点[19-23]。

根据已有的分子特征，人们已经在尝试更新胶质母细胞瘤的分子分型。VERHAAK等根据TCGA数据，将胶质母细胞瘤细胞分为前神经元型、神经元型、经典型和间质型。中国脑胶质瘤基因组图谱计划(CGGA)将脑胶质瘤分为G1、G2和G3 3个亚型[1，24]。目前已经发现多个和GBM相关的分子标志物，在判断病理类型、预后方面有一定的价值。异柠檬酸脱氢酶(IDH)是三羧酸循环中重要的酶分子，在WHOⅡ～Ⅲ级的侵袭性胶质瘤(70%～80%)和继发性胶质母细胞瘤中突变率明显升高。IDH1突变多见于弥漫性星形细胞瘤，IDH2突变多见于少突胶质瘤，两者不会出现在同一病例中。ATRX基因和地中海贫血伴智力低下综合征有关，该基因突变和端粒替代延长有关，ATRX突变常见于 WHOⅡ～Ⅲ级星形细胞瘤、部分继发性胶质母细胞瘤和部分儿童胶质母细胞瘤，可能是这些类型的GBM的标志物[24]。其他常见的突变还包括PTEN和TP53等，EGFR基因表达增高也和GBM的发生发展有关[1]。

越来越多的证据表明，非编码RNA在肿瘤发生和进展中起重要调控作用[7]。TP73-AS1和多型性脑胶质瘤的发生有关，并和患者的生存时间有一定相关性[25]。其中通过ceRNA机制调控GBM发病，已有少量文献报道。miR155HG/miRk-185/ANXA2[26]、miR-630/circMTO1[27]、AC003092.1/ miR-195/TFPI-2[28]等ceRNA网络已经在实验中得到验证[29-34]。也有人通过TCGA数据库测序数据、GEO数据或联合自己的临床标本测序数据，构建胶质母细胞瘤的ceRNA网络[35-39]，这些数据分析的结果需要进一步实验验证。

本研究对GSE103229芯片数据进行重新分析，构建ceRNA网络。因这一数据集的芯片数据包含了lncRNA、miRNA和mRNA，在构建ceRNA时，既可以通过数据库查询相互作用关系，同时也能确定这些基因是胶质母细胞瘤中的差异基因，使分析结果更为准确。

分析获得的差异基因谱中，本文列举了差异倍数较高前10个，多数基因和胶质母细胞瘤的关系无文献报道，需要进一步研究。部分lncRNA以及相关的ceRNA调控机制已经在GBM中得到验证，如lncRNA XIST可以通过抑制miR-152促进GBM的增殖和迁移[40]。本文构建的ceRNA网络中，miR-124、miR-128、miR-138和miR-193b是重要的节点基因，这些miRNA和相关的lncRNA、mRNA构成重要的肿瘤调节通路，进一步的实验验证将会对GBM的发病机制有更深入的了解。