血清miRNA-1246检测在早期乳腺癌诊断中的应用价值

陈巍，张毓#，田燕妮

1西安市中心医院普外科，西安710000

2西北妇女儿童医院妇科，西安710000

乳腺癌是中国女性发病率最高、病死率位居第6的恶性肿瘤[1-2]。近年来随着中国乳腺癌筛查工作的开展，乳腺癌早期检出率显著提高，乳腺癌患者的病死率逐年下降，但每年仍然有约7万乳腺癌患者死亡，绝大部分死亡的乳腺癌患者为晚期患者，肿瘤细胞转移是其主要的死因之一[3-4]。因此，研究乳腺癌生物标志物对提高早期乳腺癌的检出率，降低乳腺癌患者的病死率意义重大。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类在真核细胞中发现的、由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，通过对其靶基因转录水平的调控，参与调节真核细胞的生长、增殖、分化和凋亡[5]。近年来的研究表明，乳腺癌患者血清中存在多种异常表达的miRNA[6-8]，其在乳腺癌的发生发展中发挥重要的调控作用，并且是潜在的乳腺癌分子标志物，可以帮助提高乳腺癌诊断的灵敏度和特异度。miRNA-1246位于人染色体2q31.1上，研究表明，miRNA-1246在多种肿瘤组织中异常表达，且其异常表达与肿瘤细胞的生长、增殖及耐药性有关[9-11]。本研究分析了112例早期乳腺癌患者和104例乳腺良性病变患者的血清miRNA-1246表达水平，旨在探讨血清miRNA-1246检测对早期乳腺癌的诊断价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2016年1—12月于西安市中心医院就诊的早期乳腺癌患者的临床资料。纳入标准：①年龄＞18岁；②TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期；③经组织病理学检查确诊为乳腺癌；④临床资料完整。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②乳腺癌为转移病灶；④合并肝、肾功能障碍；⑤合并严重的心脑血管疾病；⑥合并慢性感染性疾病。根据纳入和排除标准，本研究共纳入112例乳腺癌患者，年龄46～72岁，平均（56.3±10.2）岁；Ⅰ期42例，Ⅱ期70例。回顾性分析同期收治的104例乳腺良性病变患者的临床资料，其中，乳腺纤维增生32例，乳腺纤维瘤29例，乳腺囊肿20例，浆液性乳腺炎23例；患者年龄为45～72岁，平均（56.4±9.5）岁。两组患者的年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 血清miRNA-1246水平检测

抽取所有研究对象的清晨静脉血5～10 ml，加入乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA），600 r/min离心 10 min，收集血清，参照miRNeasy血清/血浆试剂盒（购自德国Qiagen公司）说明书提取RNA。应用One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Ki（t购自日本Takara公司）将提取的总RNA反转录成cDNA，使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒（购自日本Takara公司）和ABI 7500荧光定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）仪（购自美国Applied Biosystems公司）检测miRNA-1246的表达水平。miRNA-1246上游引物为5'-ACACTCCAGCTGGGAATGGATTTTTGG-3'，下游引物为5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；以U6作为内参，U6上游引物为5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物为5'-AACGCTTCACGAATTTGCG-3'。 应 用 2-△Ct法（△Ct=CtmiRNA-CtU6）计算miRNA-1246的相对表达量。

1.3 乳腺癌血清肿瘤标志物检测

抽取所有研究对象的清晨静脉血5～10 ml，加入EDTA后，600 r/min离心10 min，收集血清。采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清糖类抗原15-3（carbohydrate antigen 15-3，CA15-3）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖类抗原 125（carbohydrate antigen 125，CA125）、糖类抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数表示，组间比较采用χ2检验；采用Spearman法进行相关性分析；应用受试者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析血清miRNA-1246对早期乳腺癌的诊断价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清miRNA-1246相对表达量的比较

qPCR检测结果显示，早期乳腺癌患者的血清miRNA-1246相对表达量为（1.75±0.32），明显高于乳腺良性病变患者的（1.18±0.30），差异有统计学意义（t=10.324，P＜0.01）。

2.2 血清miRNA-1246与肿瘤标志物表达水平的相关性

早期乳腺癌患者的血清CA15-3、CEA、CA125、CA19-9水平分别为（66.87±30.23）、（20.37±14.20）、（55.04±12.38）、（35.92±14.01）U/L。Spearman相关分析结果显示，早期乳腺癌患者的血清miRNA-1246水平与血清CA15-3、CEA、CA125和CA19-9水平均呈明显正相关（r=0.646、0.573、0.721、0.597，P＜0.01）。

2.3 血清miRNA-1246对早期乳腺癌的诊断价值

miRNA-1246诊断早期乳腺癌的的ROC曲线下面积为 0.783（95%CI：0.670～0.914）。当血清miRNA-1246相对表达量为1.34时，约登指数最大，此时灵敏度为90.9%，特异度为70.2%。（图1）

图1 miRNA-1246诊断早期乳腺癌的ROC曲线

3 讨论

乳腺癌是中国女性常见的恶性肿瘤之一，流行病学研究结果显示，中国每年新发乳腺癌患者占全球新发乳腺癌患者的12.2%，死亡患者占全球乳腺癌死亡患者的9.6%[12]。早发现、早治疗是乳腺癌患者成功治疗和生存的关键，目前磁共振成像、超声以及乳腺钼靶成像等乳腺癌筛查手段均存在灵敏度或特异度低的限制，并且检测价格相对昂贵，不利于广泛开展[13]。因此，寻找早期乳腺癌生物标志物对提高乳腺癌的筛查效率和范围至关重要。miRNA是一组小的非编码RNA，其可通过结合靶mRNA的3'非翻译区和5'非翻译区或编码区，对靶基因的转录和翻译进行调控，进而参与调控细胞的增殖、分化、凋亡以及人体免疫应答和肿瘤内部血管生成[5]。由于miRNA在血清、脑脊液及其他各种体液中均表达，并且能够长期稳定存在，可耐受反复冻融，是目前肿瘤标志物的研究热点[14-15]。

本研究结果显示，早期乳腺癌患者的血清miRNA-1246相对表达量明显高于乳腺良性病变患者（P＜0.01）。Kuhlmann等[16]通过微阵列芯片分析53例手术前和43例化疗后卵巢癌患者以及35例健康对照者的血清miRNA-1246表达水平，结果发现，miRNA-1246在手术前和化疗后的表达水平与卵巢癌患者的临床治疗效果或预后有关，是卵巢癌潜在的新型血清学标志物。Zhu等[17]通过转录组测序技术分析8例乳腺癌患者和8例健康对照者的miRNA-1246表达水平，结果发现，miRNA-1246在乳腺癌患者血清中的表达水平高于健康对照者，提示miRNA-1246在乳腺癌患者的血清中异常表达。

在癌变过程中，由肿瘤细胞产生、分泌，直接释放细胞组织成分，并以抗原、酶、激素或代谢产物的形式存在于肿瘤细胞内或患者体液中，这类物质称为肿瘤标志物。临床上常通过检测各项肿瘤标志物的表达水平对疾病进行诊断和分期，CA15-3、CEA、CA125和CA19-9是临床上较为常用的肿瘤标志物[18]。本研究结果显示，早期乳腺癌患者的血清miRNA-1246水平与血清CA15-3、CEA、CA125和CA19-9水平均呈明显正相关（P＜0.01），提示血清miRNA-1246是早期乳腺癌潜在的肿瘤标志物。本研究结果还显示，miRNA-1246诊断早期乳腺癌的ROC曲线下面积为0.783，当血清miRNA-1246相对表达量为1.34时，约登指数最大，此时灵敏度为90.9%，特异度为70.2%，说明miRNA-1246对早期乳腺癌具有一定的诊断价值。

综上所述，miRNA-1246在早期乳腺癌患者血清中的表达水平较高，是诊断早期乳腺癌的潜在生物标志物。