MRTFA在卵巢癌组织中的表达及对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

李娈英，杨丽霞，李雪玲，吴飒，司晓辉

1漯河市第三人民医院妇产科，河南漯河462000

2河南省焦作煤业集团中央医院妇产科，河南焦作454000

上皮性卵巢癌是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一，近年来其发病率逐渐升高，且呈年轻化趋势[1]。该肿瘤发病隐匿，多数患者确诊时已进展至晚期，且术后复发率高，容易产生化疗耐药，具有较高的病死率[2]。研究表明，卵巢癌细胞高侵袭性和转移性是影响患者预后的主要因素[3]。血清应答因子（serum response factor，SRF）作为重要的转录因子，在细胞增殖、分化、迁移、凋亡等生理功能中发挥重要作用。近年来研究发现，SRF在多种恶性肿瘤组织中高表达，且与肿瘤细胞的迁移和侵袭特性有关[4]。心肌素相关转录因子A（myocardin related transcription factor A，MRTFA）作为SAP结构域转录因子家族成员，是SRF的重要辅助因子，在SRF介导的生理功能中发挥重要作用[5]。有研究指出，MRTFA参与了肿瘤细胞的侵袭过程[6]。本研究分析卵巢癌组织中MRTFA的表达情况，并通过下调MRTFA基因表达观察其对卵巢癌细胞生物学特性的影响，以期为卵巢癌发生发展机制的研究提供基础资料，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本选取

选取2014年2月至2017年8月于漯河市第三人民医院接受手术治疗的82例卵巢癌患者的卵巢组织标本。纳入标准：术前未行放化疗；术后经病理检查确诊。排除标准：临床资料不全者。82例患者，年龄36～78岁，平均（54.2±9.8）岁；组织学类型：浆液性48例，非浆液性34例；国际妇产科联盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO）分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期15例，Ⅲ期43例，Ⅳ期6例；分化程度：低分化44例，中分化24例，高分化14例；淋巴结转移37例，无淋巴结转移45例。术中留取卵巢癌组织和癌旁组织，液氮速冻，保存于-80℃冰箱。本研究经过医院伦理委员会批准，所有患者均对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 主要试剂和设备

总RNA提取试剂盒（Trizol法）和Lipofectamine 2000转染试剂均购自美国Invitrogen公司，cDNA合成试剂盒和聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增试剂盒均购自日本Takara公司，MRTFA及内参引物均由上海生工生物工程股份有限公司设计合成，卵巢癌SKOV3细胞购自美国模式菌种收集中心（American Type Culture Collection，ATCC），DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶均购自美国HyClone公司，MRTFA干扰序列及阴性对照序列均由上海美轩生物科技有限公司设计合成，噻唑蓝（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）和二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）均购自美国Sigma公司，Transwell小室购自美国Corning公司，Matrigel基质胶购自美国BD公司，抗MRTFA抗体购自上海华壹生物科技公司，兔抗人SRF、E-钙黏素（E-cadherin）多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司，兔抗人α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）多克隆抗体购自美国Epitomics公司，实时荧光定量PCR仪和凝胶电泳分析系统均购自美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 实时荧光定量PCR技术检测MRTFAmRNA的表达取卵巢癌组织和癌旁组织，剪碎研磨，加入细胞裂解液，按RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，并用紫外分光光度计检测纯度，以A260/A280在1.80～2.20为合格。按cDNA合成试剂盒说明书将总RNA合成cDNA，应用实时荧光定量PCR仪按PCR扩增试剂盒说明书对引物进行扩增。MRTFA上游引物为5'-GGAGCCTGTAAATCTGT-3'，下游引物为5'-GACTGCATTCTGGACTAT-3'；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）上 游 引 物 为5'-CGAGACACGATGGTGAAGG-3'，下游引物为5'-TAGTTCACCCCACTACGACC-3'。反应条件：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环36次，以GAPDH为内参，应用2-△△Ct法计算卵巢癌组织和癌旁组织中MRTFAmRNA的相对表达量。

1.3.2 细胞培养及分组将卵巢癌SKOV3细胞置于DMEM培养基（含10%胎牛血清、1%链霉素和1%青霉素）中，于5%CO2、37℃培养箱中培养，胰蛋白酶消化，传代。取对数生长期细胞，按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书对细胞进行转染：MRTFA干扰组，转染MRTFAsiRNA序列5'-CUGCGUGCAUAUCAAGAACAA-3'；阴性对照组，转染阴性对照序列5'-AUGUUUGCCAUGAGUAUUA-3'；对照组，不作任何处理。转染后，各组细胞继续培养48 h，完成后续实验操作。

1.3.3 MTT法检测细胞的增殖活性取各组转染后培养48 h的细胞，胰蛋白酶消化，按1×105/孔接种于96孔板，每组设6个复孔，恒温培养。分别于培养 24、48、72、96 h时，向各孔中加入 5 mg/ml MTT溶液20 μl，培养4 h，弃去孔内培养基，各加入150 μl DMSO溶液，充分振荡使结晶物溶解，应用酶标仪检测490 nm波长处各孔的吸光度值。

1.3.4 划痕实验检测细胞的迁移能力取各组转染后培养48 h的细胞，胰蛋白酶消化，按2×105/孔接种于6孔板，37℃恒温培养过夜，用200 μl的移液枪枪头垂直于孔板进行划线，用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗掉划出的细胞，加入无血清培养基继续恒温培养，分别在0、24、48 h时拍照。细胞划痕愈合率=[0 h时宽度-24 h（或48 h）时宽度]/0 h时宽度×100%。

1.3.5 Transwell小室检测细胞的侵袭能力取Matrigel基质胶，用不含胎牛血清的培养液按9∶1进行稀释，平铺于Transwell小室的上室，37℃过夜凝固。取各组转染后培养48 h的细胞，胰蛋白酶消化，调整细胞密度为 4×105/ml，取 200 μl加入小室的上室，将600 μl含20%胎牛血清的培养液加入下室，37℃培养24 h，取出小室，甲醛固定，结晶紫染色，显微镜观察拍照，计数穿膜细胞数。

1.3.6 蛋白质印迹（Western blot）法检测MRTFA、SRF、E-cadherin和 α-SMA蛋白的表达 取各组转染后培养48 h的细胞，细胞裂解液裂解，提取总蛋白，按BCA法对蛋白浓度进行检测。取30 μg总蛋白，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白进行分离，电转移至醋酸纤维素膜，TBST冲洗3次，室温下用5%脱脂奶粉封闭120 min，加入一抗MRTFA抗体以及兔抗人SRF、E-cadherin、α-SMA多克隆抗体（稀释比例分别为1∶400、1∶800、1∶1200、1∶500），4 ℃孵育过夜，加入二抗，室温反应60 min，加入化学发光试剂，避光反应20 min，拍照，应用Image J软件对条带进行分析。

1.4 统计学分析

采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢癌组织和癌旁组织中MRTFA mRNA相对表达量的比较

卵巢癌组织中MRTFAmRNA的相对表达量为（1.86±0.12），明显高于癌旁组织的（1.15±0.10），差异有统计学意义（t=40.058，P＜0.01）。

2.2 不同临床特征的卵巢癌患者卵巢癌组织中MRTFA mRNA相对表达量的比较

不同年龄、组织学类型和肿瘤部位的卵巢癌患者卵巢癌组织中MRTFAmRNA的相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；不同肿瘤直径、FIGO分期、分化程度和淋巴结转移情况的卵巢癌患者卵巢癌组织中MRTFAmRNA的相对表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表1）

表1 不同临床特征的卵巢癌患者卵巢癌组织中MRTFAmRNA相对表达量的比较（ n=82）

2.3 细胞增殖活性的比较

培养24、48、72、96 h后，对照组、阴性对照组、MRTFA干扰组细胞的吸光度值比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；且MRTFA干扰组细胞的吸光度值均低于阴性对照组和对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表2）

表2 不同时间点各组细胞吸光度值的比较（± s）

表2 不同时间点各组细胞吸光度值的比较（± s）

注：a与对照组比较，P＜0.05；b与阴性对照组比较，P＜0.05

组别2 4 h 4 8 h 7 2 h 9 6 h

2.4 细胞迁移和侵袭能力的比较

培养24、48 h后，对照组、阴性对照组、MRTFA干扰组细胞的划痕愈合率比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）；且MRTFA干扰组细胞的划痕愈合率均低于对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。培养24 h后，对照组、阴性对照组、MRTFA干扰组的侵袭细胞数比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；且MRTFA干扰组的侵袭细胞数少于对照组和阴性对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表3、图1）

表3 各组细胞划痕愈合率和侵袭细胞数的比较（± s）

表3 各组细胞划痕愈合率和侵袭细胞数的比较（± s）

注：a与对照组比较，P＜0.05；b与阴性对照组比较，P＜0.05

组别对照组阴性对照组M R T F A干扰组F值P值划痕愈合率（%）2 4 h 5 0.3 8±4.1 5 4 7.6 8±2.4 8 2 4.5 6±2.2 3 a b 1 2 7.9 0 2 0.0 0 0 4 8 h 6 7.5 1±3.3 3 6 4.7 0±3.3 9 4 6.7 0±3.6 4 a b 6 4.0 4 7 0.0 0 0侵袭细胞数1 1 7.0 7±4.4 4 1 2 1.9 3±3.6 1 8 6.6 5±4.7 6 a b 1 1 8.7 8 4 0.0 0 0

图1 细胞划痕实验检测各组细胞的迁移能力

2.5 MRTFA、SRF、E-cadherin和 α-SMA蛋白相对表达量的比较

对照组、阴性对照组和MRTFA干扰组细胞中MRTFA、SRF、E-cadherin和α-SMA蛋白的相对表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。阴性对照组和对照组细胞中MRTFA、SRF和α-SMA蛋白的相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；MRTFA干扰组细胞中 MRTFA、SRF和α-SMA蛋白的相对表达量均低于阴性对照组和对照组，E-cadherin蛋白的相对表达量高于阴性对照组和对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。（表4）

表4 各组细胞中MRTFA、SRF、E-cadherin和 α-SMA蛋白相对表达量的比较（± s）

表4 各组细胞中MRTFA、SRF、E-cadherin和 α-SMA蛋白相对表达量的比较（± s）

注：a与对照组比较，P＜0.05；b与阴性对照组比较，P＜0.05

组别对照组阴性对照组MRTFA干扰组F值P值MRTFA 0.75±0.03 0.85±0.18 0.30±0.07a b 40.445 0.000 SRF 0.66±0.13 0.71±0.11 0.34±0.06a b 22.252 0.000 E-cadherin 0.35±0.06 0.37±0.05 0.73±0.07a b 74.836 0.000 α-SMA 0.69±0.05 0.64±0.04 0.27±0.06a b 123.039 0.000

3 讨论

卵巢癌是致死率较高的妇科恶性肿瘤之一，尽管目前治疗手段不断进步，且患者初始缓解率较高，但超过70%的患者会出现复发[7]，而复发是导致患者预后不佳的主要因素[8]。研究表明，肿瘤细胞高迁移性和侵袭性是导致复发的重要原因[9]。MRTFA是一种由807个氨基酸残基组成的SAP蛋白家族成员，是SRF重要的辅助因子，在调控SRF依赖的基因转录中发挥重要作用，与细胞增殖、分化、周期改变及迁移密切相关[10]。本研究结果显示，卵巢癌组织中MRTFAmRNA的相对表达量明显高于癌旁组织（P＜0.01），说明MRTFA在卵巢癌组织中高表达，可能参与了卵巢癌的发生。进一步分析发现，肿瘤直径≥10 cm、FIGO分期为Ⅲ～Ⅳ期、低分化和有淋巴结转移的卵巢癌患者卵巢癌组织中MRTFAmRNA的相对表达量均高于肿瘤直径＜10 cm，FIGO分期为Ⅰ～Ⅱ期、中高分化和无淋巴结转移的患者（P＜0.05），提示MRTFA可能参与了卵巢癌的发展过程。

本研究利用siRNA技术特异性抑制SKOV3细胞中MRTFA基因的表达，Western blot结果显示，MRTFA干扰组细胞中MRTFA蛋白的相对表达量低于阴性对照组和对照组（P＜0.05），提示SKOV3细胞中MRTFA基因表达被成功抑制。本研究结果显示，培养24、48、72、96 h后，MRTFA干扰组细胞的吸光度值均低于阴性对照组和对照组（P＜0.05），说明特异性抑制细胞中MRTFA基因的表达可有效抑制细胞的增殖活性，提示MRTFA可能参与了细胞的增殖过程。培养24、48 h后，MRTFA干扰组细胞的划痕愈合率均低于阴性对照组和对照组；培养24 h后，MRTFA干扰组的侵袭细胞数少于阴性对照组和对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），说明特异性抑制细胞中MRTFA基因的表达可减少细胞的迁移及侵袭能力。研究表明，上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在肿瘤细胞的迁移与侵袭过程中发挥关键作用[11]。而SRF则在EMT过程中发挥重要作用，与促进肿瘤细胞获得间质细胞特性密切相关[12]。E-cadherin是EMT过程的直接标志物，而α-SMA则是EMT过程的间接标志物，发生EMT时，E-cadherin蛋白表达量降低，而α-SMA蛋白表达量升高[13]。本研究结果显示，MRTFA干扰组细胞中MRTFA、SRF和α-SMA蛋白的相对表达量均低于阴性对照组和对照组，E-cadherin蛋白的相对表达量高于阴性对照组和对照组，（P＜0.05），说明特异性抑制细胞中MRTFA基因表达，可能抑制了SRF蛋白介导的EMT过程，提示MRTFA可能通过SRF蛋白介导的EMT过程参与细胞的迁移和侵袭过程。

综上所述，卵巢癌组织中MRTFA蛋白呈高表达，且表达水平与肿瘤的恶性程度有关，特异性抑制MRTFA基因表达可有效抑制细胞的增殖、迁移和侵袭能力，其机制可能与抑制SRF蛋白介导的EMT过程有关。