乙肝病毒DNA检测2种不同核酸提取方法的性能验证情况分析

董 剑，许小华

（联勤保障部队第909医院检验科，厦门大学附属东南医院检验科，福建漳州 363000）

0 引言

乙型肝炎也被称为乙肝，是目前世界上最常见的一类传染病，据不完全统计[1]，在全世界范围每年至少有100万以上的患者死于乙肝。慢性乙肝携带者大约占世界总人口的10%以上，而超过20%的急性乙肝患者会转为慢性乙肝，随着病情进展逐渐发展为肝硬化甚至肝癌，因此早期准确判别乙肝对患者的预后尤为重要[2]。实时荧光定量PCR检测乙肝病毒DNA（HBV-DNA）是一种能够早期诊断乙肝、能够获得准确性较高的检测结果并可进行量化的检测方法。在利用荧光定量PCR仪检测HBV-DNA前，往往需要对临床标本提取样本DNA。目前，实验室较常用的提取样本DNA的方法为手工提取（煮沸法）和核酸全自动提取仪提取（磁珠法）。本研究在相同的检测试剂和核酸扩增仪的实验条件下利用手工法和核酸全自动提取仪法分别提取样本DNA，并进行性能验证得出实验数据，从而选择更合适HBVDNA的核酸提取系统，达到优化HBV-DNA检测流程的目的。

1 资料与方法

1.1 研究资料

选择2018年1—9月在我院检验科分子生物实验室检测的临床样本血清。所有临床标本均在空腹状态抽取静脉血3～5 ml于真空采血管中，3 000 r/min离心10 min分离血清，4～8℃放置12 h待测。

1.2 仪器试剂

实时荧光定量PCR检测采用美国ABI7500型实时荧光定量PCR仪（Thermo Fisher Scientific公司），检测试剂用乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法，中山达安基因）。全自动核酸提取仪采用中山达安基因公司生产的smart 32型全自动核酸提取仪。手工法提取核酸试剂采用中山达安公司的DNA提取液；全自动核酸提取仪法提取核酸试剂采用中山达安公司的核酸提取或纯化试剂盒。

1.3 荧光定量PCR反应体系和反应参数

（1）反应体系：50 μl。

（2）ABI7500核酸扩增仪上反应参数：93℃2min；93 ℃45 s，55 ℃60 s，10个循环；93℃ 30 s，55℃ 45 s，30个循环。

2 实验设计

对收集的临床样本同时采用手工法和核酸全自动提取仪法提取样本DNA，依据《医学实验室质量和能力认可准则》，对采用以上2种方法提取的HBVDNA分别进行批内精密度、批间精密度、正确度、线性范围验证。对2种方法的性能验证结果进行比较。本文中所有实验操作均依照《全国临床检验操作规程》进行[3]。

2.1 批内精密度

收集临床浓度为2.43×106copies/ml的高值血清样本和浓度为2.81×103copies/ml的低值血清样本。高值血清、低值血清样本由同一操作人员分别利用手工法和核酸全自动提取仪法各提取样本DNA 10份（共计40份），上机检测，结果取对数，分别计算高值血清和低值血清利用手工法和核酸全自动提取仪法的批内精密度，并进行统计分析。

2.2 批间精密度

采用本实验室购买的达安公司生产的高值（强阳性）质控血清，浓度为 2.21×106copies/ml，批号为2017006，每个工作日分别用手工法和核酸全自动提取仪法提取DNA后，上机检测，检测结果取对数值。采用2018年9月1—30日的质控数据进行统计（共计21个质控数据）。对检测结果取对数值，然后进行t检验分析。

2.3 正确度

分别利用手工法和核酸全自动提取仪法检测可溯源的标准品4份（中山达安，批号20180404），每份标准品分别用不同的核酸提取方法提取3次DNA，然后上机检测，结果取均值。分别计算偏倚：偏倚%=（测量值-理论值）/理论值×100%[4]。偏倚小于±7.5%，表示满足临床需求，可以接受[5]。对检测结果取对数值，然后进行t检验。

2.4 线性范围

取一份高值血清，浓度为2.43×108copies/ml，将此样本的浓度当作100%。再用正常人血清（乙肝阴性）分别按不同浓度稀释为 2.43×107、2.43×106、2.43×105、2.43×104、2.43×103、2.43×102copies/ml，每份血清提取HBV-DNA后重复测定3次，取均值。将实际测量均值的对数值设为X，稀释血清浓度预测值的对数值设为Y，作线性回归分析[6]。得出回归方程Y=bX+a，相关系数为R2。相关系数R2越接近1，说明相关性越好。

2.5 临床样本结果比对

选取40个样本（需覆盖分析测量范围），分别用手工法和核酸全自动提取仪法提取DNA，然后上机检测HBV-DNA浓度，结果取对数，计算偏倚，并进行直线回归分析。其偏倚应＜±7.5%。

2.6 统计方法

应用SPSS 15.0软件对数据进行处理，数据以均值±标准差（±s）表示，采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 批内精密度

分别比较核酸全自动提取仪法和手工法的临床样本高值和低值血清，核酸全自动提取仪法批内精密度较手工法变异系数（coefficient of variation，CV）更小，其批内精密度更好。对以上2种方法提取高、低值血清HBV-DNA进行检测的批内精密度结果分别进行t检验，P＜0.001，说明2种方法批内精密度的差别有统计学意义。实验结果见表1。

表1 手工法和核酸全自动提取仪法批内精密度验证结果（n=40）

3.2 批间精密度

手工法和核酸全自动提取仪法的CV值分别为3.29%、2.84%，P＜0.001，2种方法批间精密度的差别有统计学意义。从测定结果可以看出全自动核酸提取仪法较手工法CV值更小，其批间精密度更好。具体结果见表2。

表2 手工法和核酸全自动提取仪法高值质控品批间精密度验证结果（n=21）

3.3 正确度

手工法和核酸全自动提取仪法检测结果取对数值后偏倚均小于±7.5%，其中核酸全自动提取仪法偏倚比手工法更小，差异均无统计学意义（P＞0.05）。具体结果见表3。

表3 手工法和核酸全自动提取仪法正确度验证结果

3.4 线性范围

全自动核酸提取仪法回归方程为Y=1.048X-0.281 7，R2=0.985 8；手工法回归方程为Y=1.020X-0.043 4，R2=0.966 0，对2种方法的相关系数分别做t检验，P均＜0.01，说明两者在浓度为 2.43×102～2.43×108copies/ml的范围内线性较好，能满足临床需求。具体结果如图1、2所示。

图2 手工法线性分析图

3.5 临床样本结果比对

分别用手工法和全自动核酸提取仪法检测40份临床样本（覆盖分析测量范围），其偏倚均小于±7.5%，相关性好，回归方程为Y=1.019 9X+0.045 7，R2=0.912 7。对2种方法检测结果的相关系数进行t检验，P＜0.01，说明2种方法检测结果有显著的相关性。具体结果如图3所示。

图3 全自动核酸提取仪法和手工法检测40份临床样本相关线性分析

4 讨论

从本研究的结果可以看出，全自动核酸提取仪法高值和低值血清的批内精密度（CV）分别为1.78%和2.44%，手工法高值和低值血清的批内精密度（CV）分别为2.18%和3.76%；用高值质控品分别做全自动核酸提取仪法和手工法的批间精密度（CV），结果分别为2.84%和3.29%；分别用2.0×103、2.0×104、2.0×105、2.0×106copies/ml的标准品进行2种方法的正确度验证，全自动核酸提取仪法的偏倚分别为-2.37%、-0.95%、0.74%、-1.33%，手工法的偏倚分别为-4.88%、-2.51%、-2.46%、-2.12%。全自动核酸提取仪法的批内和批间精密度与手工法相比，CV值更小，其正确度平均偏倚也均小于手工法。其原因可能是由于不同的实验人员操作习惯和熟练程度的不同，导致提取DNA的效率也不同。全自动核酸提取仪法提取DNA中途无需人工操作，可以避免由于人员的操作而带来的结果的偏差。对2种方法的线性范围分析和临床比对实验可以看出，全自动核酸提取仪法和手工法在较宽的线性范围内均有良好的线性，能够满足临床实验的要求，二者实验结果具有较好的相关性。

全自动核酸提取仪法提取DNA的原理是磁珠法，其利用磁性硅胶对DNA进行特异性吸附，在磁场的作用下分离并获取DNA，实验中无需离心和有机溶剂的使用。手工法提取DNA需要先用沉淀的方法去除蛋白质，然后利用高速离心、加热裂解等方法提取DNA，其实验步骤较多，实验过程也难以做到标准化。综合以上实验结果，可以看出采用全自动核酸提取仪法提取DNA，其批内精密度和批间精密度均较手工法更好，其重复性更好。

全自动核酸提取仪法提取核酸需要使用全自动核酸提取仪以及相应的提取试剂和配套耗材，而手工法提取核酸无需特殊仪器，耗材的成本也低于全自动核酸提取仪法，全自动核酸提取仪法提取核酸成本要高于手工法提取核酸。但手工法提取核酸每一步加样本血清和试剂均需手工加入，增加了操作过程中样本间交叉污染的可能性。本实验中所使用的smart 32型全自动核酸提取仪提取核酸中途无需手工操作，对于各样本均有独立的一次性耗材，从而可以避免操作过程中人为错误以及样本间交叉污染的问题。该型全自动核酸提取仪一次可以提取48份血清样本，提取时间约30 min，可以很好地满足小、中型实验室的需求；而手工法提取48份血清样本，耗时约50 min。总体来说，本实验中全自动核酸提取仪法提取DNA成本比手工法成本高1～2倍，平均耗时节约20 min左右，同时可以很好地节约实验室的人力资源。

总体来说，从检测可重复性、灵敏度、提取效率等方面考虑，全自动核酸提取仪法提取HBV-DNA要优于手工法。HBV-DNA检测相较于其他的乙肝相关性检测有窗口期短、特异性好等特点，其动态变化又可作为抗病毒疗效检测以及抗药性是否形成的重要指标[7]。本实验中所使用的smart 32型全自动核酸提取仪为国产仪器，相较于进口仪器来说，其具有降低医院运营成本和推动分级诊疗的优势[8]。医疗设备目前正向着小型化、便携化的方向发展[9]，与生化和免疫实验室相比，分子生物实验室自动化程度较落后，全自动核酸提取仪法提取HBV-DNA有利于简化DNA提取流程，有利于分子生物实验室实现自动化提取核酸。