一种透射电镜痕量生物样品制样方法的介绍

曲宝清 张翠萍 张 琪

(北京市神经外科研究所 首都医科大学附属北京天坛医院，北京 100070)

透射电镜技术是生物学、医学研究和临床诊断的重要方法。其中有些样品数量少、体积小且相对分散，给样品制备带来困难。以细胞样品的特点为例，如体外培养的细胞和来源于外周血及骨髓的细胞等，都是数量较少，难以成团。在繁琐的样品制备过程中即便是细胞团块也极易碎裂或分散。另外还有一类小体积样品，无法离心成团，如：拟南芥根尖。以往实验室多用明胶预包埋法处理这类样品，该方法的明胶温度难以控制，操作不便[1]。针对上述样品的特点本实验室采用包裹法对细胞样品进行简单处理，既保证了样品原有数量，又不影响包埋效果。本文以体外培养的Vero细胞和拟南芥根尖为例对这种方法做一详述。

1 材料和方法

1.1 样品的收集和固定：

用橡胶细胞刮轻轻刮下Vero细胞，以1500 rpm/min的离心速度，离心处理10min，使细胞成团[2,3]，细胞数量不少于105个。离心处理后用塑料移液管吸出上清液，使用0.1M磷酸盐缓冲液或砷酸盐缓冲液清洗，加入4℃预冷的戊二醛固定液，并于4℃固定2h。注意添加液体需沿离心管壁缓慢加入，尽量不要将细胞团块冲散。

用上述固定方法固定、洗涤拟南芥根尖，拟南芥根尖一般大小约1mm，注意吸液体时不要用力过大使样品丢失。

细胞和拟南芥根尖样品如图1所示。

图1 Vero细胞和拟南芥样品。A图为细胞样品，在离心管底部可见一小块细胞团；b图为拟南芥根尖，样品大小约1mm。

1.2 样品的包裹处理

包埋前对细胞样品做特殊的包裹处理。准备一支新塑料移液管，将其尖端部分剪掉一小段，便于较大的细胞团块进出。

将普通擦镜纸剪成边长为1cm的小片(如图2所示)，平放于体式显微镜载物台上，用剪掉尖端的移液管吸取细胞团块或拟南芥根尖，滴加在擦镜纸中心，借助体式显微镜观察，并用眼科镊轻轻将擦镜纸四边折起即可(如图3所示)。

图2 擦镜纸和滴加样品a图为修剪厚度擦镜纸，1cm大小；b图为a图在扫描电子显微镜下观；c图为用剪掉尖端的移液管将样品滴加至擦镜纸中心。

图3 样品包裹图示。a图折叠样品示意图；b图用剪掉尖端的移液管将样品滴加至擦镜纸中心；c～f图依次折起擦镜纸四边折起

1.3 后固定和包埋

本实验室使用组织包埋处理机Leica EM TP进行包埋。将上述包裹好的细胞样品置于组织篮中(见图4)，即可以按常规进行后续锇酸固定、乙醇脱水、环氧丙烷置换，Epon 812树脂浸透等处理。包埋时需仔细观察样品情况，经锇酸后固定后，样品呈现黑色，对于拟南芥根尖样品可以小心打开纸包，按照需要的包埋方向进行包埋。对于细胞样品，如有明显的细胞团块，可以在打开擦镜纸后用镊子轻轻托取团块转移入包埋板或者胶囊；如观察不到明显的细胞团块，则无需去除擦镜纸，直接转移入包埋板包埋即可。将包埋板置于烤箱，37℃过夜，60℃聚合24小时。

图4 包裹后样品入篮

1.4 样品后续常规超薄切片制备和染色

待树脂聚合后，对上述样品进行常规修块、超薄切片制备、柠檬酸铅和醋酸双氧铀染色。使用日立透射电子显微镜H-7650对样品超薄切片进行观察和拍照。

2 结果观察

在电镜下观察拟南芥样品的超微结构清晰，锇酸后固定和树脂浸透良好。小细胞团容易在电镜下进行观察和拍照。对于数量较低的细胞样品可见单个细胞散布于擦镜纸纤维的间隙中间，可对其进行观察和拍照，如图5。

图5 电镜超微结构a图为拟南芥根尖低倍超微结构图，可见结构完整；b图为拟南芥根尖高倍超微结构，可见树脂浸透良好，细胞器结构清晰；c图为透射电镜下Vero细胞超低倍照片，可见细胞散在分布；d图为Vero细胞高倍照片，可见细胞固定良好，树脂浸透均匀，超微结构清晰(a, c, Bar=5μm; b, Bar=1μm; d, Bar=2μm)。

3 注意事项

3.1 贴壁细胞收集

建议贴壁培养的细胞尽量使用细胞刮下的处理方式，以保证细胞的形态不发生改变。胰酶消化也是常用的收集细胞的方法，但是经胰酶消化后的细胞突起回缩，胞体趋于圆形，对镜下的观察有一些影响。

3.2 细胞的离心

不要因为样品量少使用过高的转数离心。离心力过大可能导致细胞变形，并使细胞超微结构产生假象。细胞离心速度控制在1500rpm/min以内，离心10min即可[2]。

3.3 细胞转移和洗涤

从细胞收集到入包埋板，细胞团需要经过几次转移，转移过程中切记动作轻缓。不要用镊子夹取，较大细胞团块可以用镊子托取，较小团块可用塑料移液管转移。注意塑料移液管剪掉尖端，以免过于狭窄卡住细胞团块，塑料移液管不要反复吹打细胞团，尽量一次吸完。细胞洗涤时添加液体注意沿管壁缓慢添加，切勿将团块冲散。向擦镜纸滴加细胞悬液时注意一滴一滴添加，每添加一滴后，等液体渗透出擦镜纸，再滴加下一滴，以免液体量过大，将细胞冲出擦镜纸。

3.4 细胞包裹纸张的选择

对于纸张的选择，应选具有一定吸水能力，占体积小，尽量薄，不影响浸透，还需要柔软，以便于折叠。基于上述考虑，擦镜纸是较好的选择。

4 讨论

“明胶包埋法”虽然可以准确定位到需要的部位，但需注意包埋样品的琼脂不能太厚，明胶的温度也难以控制，操作很不方便。“纸巾包裹法”与“明胶包埋法”相比较操作简单，大大提高了工作效率，同时又有效地避免了组织处理过程中样品的丢失，是一种易于操作和掌握的方法。但是需要注意的是，在每次漂洗时需注意吸管或枪头的尖端不要扎破擦镜纸，否则样品会从破洞中漏出，在每一步的清洗过程中会造成“损耗”。总之，对于痕量生物样品而言，包埋前对样品的包裹处理是一种简便有效的处理方法。

5 结论

透射电镜生物样品制备过程时间长，程序复杂，对于体积微小、分散的生物样品，其制备难度大，对于这类样品需要进行特殊处理[3]。虽然传统方法能获得理想的包埋效果，但是本文经过改良后的样品包裹法更加简单快速，不仅操作方便，易于掌握，更能克服大量样品在多次漂洗过程中的“损耗”，尤其是对于珍贵的生物样品，不但保证了样品的数量，也获得了高质量的电镜图片。