非小细胞肺癌组织中LCAL1的表达变化及意义

孟腾，徐美林

(1天津医科大学，天津 300070；2天津市胸科医院)

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，从组织学上可分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，其中后者占全部肺癌患者数的80%以上。肺癌患者5年生存率不足20%，虽然手术、化疗、放疗和阻断表皮生长因子受体通路改善了NSCLC患者的预后，但晚期患者的生存率仍然很低[1,2]。早期诊断、早期治疗和新靶向药物的出现会大大提高NSCLC的存活率，因此研究NSCLC患者的潜在靶点对于提高生存时间和治疗效果具有十分重要的意义，寻找新的肺癌诊断标志物成为当今研究热点。lncRNA是一类转录本长度超过200个核苷酸(nts)的RNA分子，不编码蛋白，参与多种生物的过程，包括染色质修饰、基因印迹、基因转录和选择性剪接，其参与调控各种生物过程，如细胞增殖、分化、生长、运动、凋亡等[3～7]。近年来，lncRNA在肿瘤中的作用已经越来越引起临床的关注。本研究观察NSCLC组织中lncRNA LCAL1表达变化，分析LCAL1表达与NSCLC患者临床病理参数、预后的关系，并探讨其意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2014年1月～2016年6月天津市胸科医院收治的NSCLC患者55例，男33例，女22例；TNM分期1期29例，2～4期26例，肿瘤直径≤3 cm 31例，>3 cm 24例；组织病理类型为腺癌31例，鳞癌24例；23例有淋巴结转移。所选患者术前均未行局部或全身放疗或化疗，均有完整的临床和病理组织学资料，至少由2位病理学专家进行诊断。手术留取NSCLC组织及癌旁(距癌边缘>5 cm)正常肺组织各55例份，所有组织样本取下后立即液氮冷冻，随后转入-80 ℃冰箱保存。本次研究获得天津市胸科医院伦理委员会认可。

1.2 组织中LCAL1检测方法 取50 mg冻存组织，磨成粉末状，加TRIzol抽提RNA。按照说明书操作。组织中抽提RNA后，使用紫外分光光度计检测其纯度及浓度，取吸光度(A260/280)为1.8～2.0的RNA样本，按逆转录试剂盒说明书将RNA样本逆转录为cDNA，反应条件：30 ℃、10 min，95 ℃、5 min。采用VIIA7 DX实时荧光定量PCR仪分析，按照SYBR Green说明书配制反应总体系20 μL：2×SYRR Green 10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，RNase free ddH2O 6 μL。反应条件如下：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸34 s，共40个循环。PCR结束后，分析各孔的CT值(每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)，用2-ΔCt和2-ΔΔCt分析LCAL1的相对表达量和表达倍数[8]。计算出标化后的2-ΔCt(其值越大，起始拷贝数越多)，ΔCt=样本Ct均值-内参Ct均值，设对照组目的基因的量为1，则实验组目的基因的量为对照组目的基因的量的2-ΔΔCt倍，ΔΔCt=[(样本Ct目的基因一样本Ct内参基因)-(对照组Ct目的基因-对照组Ct内参基因)]，以2-ΔΔCt代表目的基因的相对表达量，设定2-ΔΔCt≥1为阳性表达。

2 结果

2.1 NSCLC及正常肺组织中LCAL1表达比较 NSCLC及正常肺组织LCAL1表达水平分别为0.15(0.08，0.22)、0.05(0.016，0.14)，两者比较，P<0.05。

2.2 组织中LCAL1表达与NSCLC临床病理参数的关系 LCAL1表达与NSCLC临床病理参数的关系结果见表1。

表1 LCAL1表达与NSCLC临床病理参数的关系

注：由表1可知，LCAL1表达与NSCLC患者肿瘤直径、淋巴结转移、临床分期有关(P均<0.05)。

2.3 组织中LCAL1表达与NSCLC患者预后的关系 按照LCAL1表达水平将NSCLC患者分为LCAL1高表达者(34例)和LCAL1低表达者(21例)，两者中位生存时间分别为30个月、48个月，两者比较P<0.05。

3 讨论

肺癌作为全球最为常见的恶性肿瘤之一，近年来其发病率与病死率呈上升趋势。女性肺癌发病率位于第4位，病死率位于第2位；男性其发病率占首位，同时也是导致男性恶性肿瘤死亡的重要原因[9,10]。肺癌最常见的病理类型是非小细胞肺癌，其预后相对于小细胞肺癌患者来说较好。有关调查研究显示，NSCLC患者早期如果能够得到确诊的话，可以通过手术，放疗和化疗等治疗方法获得较好的预后，但是即便如此，NSCLC的总体5年生存率仍然很低，不足20%[11～13]。由于肺癌起病隐匿，早期患者的临床表现并不典型，病症显现初期，肺癌患者的症状通常为非特异性，例如咳嗽、气短、咳血或肺炎。随着病情的进展，会出现阵发性刺激性呛咳为特征的突发咳嗽，或长期频繁的咳嗽，出现咳嗽性质的改变，但是一般不会咳出痰液或仅有少量白色泡沫样痰咳出。此外，症状较轻且定位模糊的胸背痛、胸闷等症状也可能出现[14]。我国肺癌的诊疗技术已取得了很大的进步，从传统的单一手术切除治疗发展到现在的切除、放疗与化疗三者组合式联合治疗，再到通过对肺癌生物学机制的深入研究，发现新的生物学标记物和靶向治疗的有效运用。各种调控基因在肺癌发生中起到十分关键的作用，复杂的、多步骤的转移过程是由特异的基因产物与基因突变决定的。故探讨肺癌发生发展的机制具有重要意义。

人类基因组包含约51 382个lncRNA基因，20 000～25 000个蛋白质编码基因和约2 500个miRNA。许多lncRNAs表现出时空和组织特异性的表达模式，这表明lncRNAs的表达在组织发育和发病过程中都是程序化和高度调控的。在lncRNAs的核酸结构中，存在着与其他RNA(如mRNA和miRNA)结合的固有能力，这些RNA与lncRNAs或不完全或完全互补。lncRNA通过直接与mRNA相互作用，在mRNA剪接、编辑、亚细胞分布和稳定性调控中发挥关键作用[15]。虽然现在对于lncRNA的三维结构了解较少，但lncRNAs与蛋白质、DNA、RNA和金属离子等其他分子相互作用，形成合适的三级结构来发挥其功能，这一点越来越明显。lncRNA影响各种生物过程的潜在分子机制，包括染色质修饰、表观遗传调控、基因转录和翻译、RNA转换和基因组防御等，已被广泛综述[16]。lncRNA作为重要的调控因子，已成为肿瘤防治的研究热点。LCAL1定位于染色体6q14.1，产生有三个外显子转录本，在亚细胞定位中显示了LCAL1在细胞核中富集。ENCODE数据库显示去氧核糖核酸酶和转录因子在LCAL1上游结合，提示LCAL1启动子有调控活性。有研究[17]发现使用siRNA 1和siRNA 2敲除H322M和HCC95细胞系中的LCAL1，结果显示细胞生长减少；在控制细胞系BEAS-2B中，稳定的过表达LCAL1，使用两个不同的克隆，从第2天开始，到第6天实验结束，细胞增殖活性增强。从上述实验可得出LCAL1促进癌细胞的增殖。

本研究显示，NSCLC组织中LCAL1表达水平高于配对癌旁正常组织，提示LCAL1可能与癌细胞的增殖有关。进一步分析发现，肿瘤直径>3 cm的LCAL1阳性表达高于肿瘤直径≤3 cm，可能的原因是肿瘤直径可反映肿瘤负荷情况，LCAL1在肿瘤体积较大的患者中合成与释放的更多；T2～T4期的LCAL1阳性表达高于T1期，提示NSCLC的恶性程度可能与LCAL1表达水平有关，LCAL1水平越高，NSCLC的恶性程度越高，猜测LCAL1参与了NSCLC的恶性转化；组织LCAL1表达水平与淋巴结转移情况有关，有淋巴结转移者的LCAL1阳性表达相对较高，提示LCAL1可能参与了NSCLC的侵袭转移过程。此外，LCAL1高表达者生存率显著低于LCAL1低表达者，提示LCAL1阳性表达与NSCLC患者的预后不良相关，LCAL1可能调控肿瘤转移和侵袭，提示其在预测NSCLC患者预后上有一定价值。

总之，LCAL1在肺癌组织中高表达，且与肿瘤直径、淋巴结转移和临床分期及患者预后相关，可能在肺癌发生发展中有一定作用。但是，目前人们对于LCAL1肺癌的肿瘤细胞的生长、侵袭、增殖、分化、转移和凋亡等具体调控机制的了解仍非常有限，更深层次的机制仍有待进一步的探索，尽管具体分子机制尚不清楚，但上述研究结果仍提示lncRNA LCAL1与NSCLC的发生发展有关，并有可能成为评估NSCLC患者预后的新的指标。