2型糖尿病患者颈动脉内膜中层厚度与基因启动子-156位点G/C多态性的关系

李明政,邓建新,陈淑娟

(深圳市第二人民医院,广东深圳 518000)

2型糖尿病(T2DM)是临床最为常见的基础疾病之一，由遗传、环境等因素共同作用所致，以糖代谢紊乱为主要临床特征[1,2]。近年来，随着人们生活水平的逐渐提高，加之饮食习惯的不断改变，T2DM的发病人数日益增多[3,4]。研究显示，动脉粥样硬化是导致T2DM患者死亡的重要原因，而颈动脉内膜中层厚度(CIMT)是目前临床广泛用以评估机体动脉粥样硬化情况的有效指标，且与糖尿病早期大血管病变的发生有一定相关性[5]。另有研究报道证实，在T2DM患者中趋化因子配体5浓度与CIMT呈正相关，趋化因子配体5在急性冠脉综合征的发生中起重要作用[6]。由于基因启动子-156位点是趋化因子配体5的重要位点，具有一定的G/C多态性，因此推测趋化因子配体5基因启动子-156位点G/C多态性可能与T2DM患者CIMT密切相关。2018年4月，我们探讨了T2DM患者CIMT与基因启动子-156位点G/C多态性的关系，旨在为临床T2DM的治疗提供新的靶点和思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年4月～2018年4月我院收治的T2DM患者180例，纳入标准[7]：①患者均符合T2DM相关诊断标准；②年龄≥18周岁；③无临床资料缺失。排除标准：①合并肝、肾、肺等脏器功能严重受损者；②伴有严重心脑血管疾病、急慢性感染性疾病、免疫系统疾病及严重糖尿病急性代谢并发症者；③无法正常交流或存在神经系统疾病者；④正参与其他研究者。入选的180例T2DM患者男95例、女85例，年龄33～82(51.03±11.54)岁；BMI 19～30(25.74±3.51)kg/m2。本研究经医院伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 CIMT测量 采用颈动脉超声进行测定，检测仪器为ACUSON X300型彩色多普勒超声诊断仪(德国西门子公司)，设置探头频率为7.5～12 MHz。按照CIMT的不同分成单纯T2DM组(CIMT≤0.9 mm)及CIMT增厚组(CIMT为0.9～1.3 mm)。

1.3 血液生化指标检测 采用全自动生化分析仪检测空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平；采用放射免疫法检测空腹胰岛素(FINS)水平，并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)值，HOMA-IR=FPG×FINS/22.5。

1.4 基因启动子-156位点G/C多态性检测 采用多聚酶链式反应限制性片段长度多态性技术。首先采集患者空腹外周静脉血2 mL，通过非离心柱型DP319-01试剂盒，提取白细胞基因组DNA。随后参照基因库以及文献资料设计PCR扩增目的片段：正向引物：5′-CTCCTCCTGGCCACCCTGC-3′，反向引物：5′-TCAAGCTTTGGGATGCTGGGGAA-3′。PCR反应体系包括15 μL的PCR缓冲液；10 mmol/L dNTPS 4.0 μL；正反向引物各4.0 μL；DNA产物4.0 μL；Tap酶0.5 μL，加水至50 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃ 30 s、61 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40个循环。扩增片段长度114 bp，分离纯化扩增产物，测序并和GeneBank中的基因型对比，并通过NRU1限制性内切酶予以酶切处理。随后将酶切产物通过15%聚丙烯酰胺电泳，以溴乙锭染色30 min，于紫外灯下观察基因型。

2 结果

2.1 两组临床及实验室相关指标比较 单纯T2DM组78例，男40例、女38例，年龄(48.32±10.66)岁，BMI(25.62±3.47)kg/m2；CIMT增厚组102例，男55例、女47例，年龄(55.76±12.33)岁，BMI(25.83±3.35)kg/m2，两组性别、BMI比较差异无统计学意义。单纯T2DM组年龄、FINS、HOMA-IR、TC、LDL-C水平较CIMT增厚组低(P均<0.05)，见表1。

表1 两组实验室相关指标比较

2.2 两组基因启动子-156位点G/C多态性比较 CIMT增厚组基因启动子-156位点GG基因型比例较单纯T2DM组低，而CC基因型比例较单纯T2DM组高(P均<0.05)，见表2。

表2 两组基因启动子-156位点G/C多态性比较[例(%)]

2.3 T2DM患者CIMT与各因素的相关性分析 PT2DM患者CIMT与基因启动子-156位点CC基因型、年龄、FINS、HOMA-IR、LDL-C均呈正相关(r分别为0.632、0.683、0.602、0.711、0.589，P均<0.05)。

2.4 影响T2DM患者CIMT增厚的多因素Logistic回归分析 多因素Logistic回归分析结果显示，基因启动子-156位点CC基因型、年龄、In(HOMA-IR)、LDL-C均为T2DM患者CIMT增厚的独立危险因素(P均<0.05)。见表3。

表3 影响T2DM患者CIMT增厚的多因素Logistic回归分析

3 讨论

流行病学研究表明，T2DM可在一定程度上增加心血管疾病患者的发病率及病死率，其中有50%以上的T2DM患者死于动脉硬化性疾病[8～10]。内膜增厚是动脉粥样硬化早期病理改变，且有研究证实CIMT与心血管疾病的危险因素呈正相关[11，12]。颈动脉作为全身中型动脉窗口之一，其硬化程度和冠心病及外周动脉硬化性疾病存在密切关系，且CIMT增加可作为预测心血管病发病及病死率的独立危险因素。因此，通过测量CIMT可作为早期动脉粥样硬化的有效指标。另有研究报道表明，炎症在冠状动脉疾病的发生发展中起重要作用，特别是对于趋化因子于动脉硬化形成及斑块破裂过程中所发挥的作用越来越受重视[13，14]。炎症细胞可能通过直接或间接作用导致血管内皮损伤，同时促使一氧化氮功能降低，甚至失活，并迅速分解释放出大量的自由基引发血管痉挛及脂质代谢紊乱，从而促进动脉粥样硬化的发生发展。炎症可能是启动冠状动脉粥样硬化过程的启动子。其中趋化因子配体5可于损伤部位募集中性粒细胞，从而加剧局部炎症损伤，进一步促进CIMT增厚，最终在冠状动脉疾病的进程中发挥重要作用[15,16]。

趋化因子配体5基因位于染色体4q13-q21，其中存在两个单核苷酸多态性位点：启动子区域的-156G>C，外显子398G>A，而启动子区域的-156G/C基因多态性直接影响趋化因子配体5基因的表达。趋化因子配体5作为趋化因子超家族的CXC亚族成员之一，参与了炎症、变态反应、自身免疫性疾病及肿瘤的发生发展，有极强的粒细胞趋化作用。本研究结果显示，CIMT增厚组基因启动子-156位点GG基因型人数占比较单纯T2DM组低，而CC基因型人数占比较单纯T2DM组高，与刘波等[17,18]报道结果类似，说明基因启动子-156位点G/C多态性可能与T2DM患者的CIMT密切相关。推测基因启动子-156位点G/C多态性可能通过影响趋化因子配体5的表达，进一步对CIMT产生影响，最终导致冠状动脉疾病的发生。此外，单纯T2DM组年龄、FINS、HOMA-IR、TC、LDL-C水平较CIMT增厚组低，而HDL-C水平较CIMT增厚组高，与既往研究高度一致[19]，说明上述各项因素均可能影响T2DM患者的CIMT水平。年龄是目前临床所公认的动脉硬化危险因素之一，而FINS、HOMA-IR水平的增高易致高胰岛素血症的发生，进一步对动脉平滑肌增生产生刺激作用、降低纤溶酶活性，同时可启动机体免疫系统，促进机体持续、轻微的慢性炎症发生，继而可能引发动脉硬化。TC、LDL-C水平是目前临床应用最为广泛反映机体血脂代谢情况的有效指标，而血脂代谢紊乱会对机体的血管内皮功能产生影响，促进动脉硬化的发生[20]。另外，经Pearson相关性分析发现，T2DM患者CIMT与基因启动子-156位点CC基因型、年龄、FINS、HOMA-IR、LDL-C均呈正相关。表明基因启动子-156位点G/C多态性与T2DM患者CIMT密切相关。原因可能是基因启动子-156位点G/C多态性会对趋化因子配体5的浓度产生影响，进一步影响JAK/STAT/SOC信号通路抑制胰岛素在肌肉中的作用，进一步对胰岛素抵抗造成影响，引起胰岛素抵抗。而胰岛素抵抗是T2DM及动脉粥样硬化的共同发病基础，高胰岛素血症会刺激动脉平滑肌增生，同时降低纤溶酶活性，激活机体免疫系统，促使机体出现持续且轻微的慢性炎症，最终引发动脉粥样硬化[21～23]。进一步多因素Logistic回归分析发现，基因启动子-156位点CC基因型、年龄、HOMA-IR、LDL-C均是影响T2DM患者CIMT增厚的独立危险因素。再次证实上述因素可能会影响T2DM患者CIMT增厚。其中趋化因子配体5基因-156位点多态性可能通过增加胰岛素抵抗、加剧脂代谢紊乱及炎症反应，从而促进动脉粥样硬化。

综上所述，T2DM患者CIMT与基因启动子-156位点G/C多态性有关,基因启动子-156位点G/C多态性可能在T2DM患者CIMT增厚过程中发挥促进作用。