基于ITS序列对市售常见食用菌的鉴定及系统发育研究

宋立志

(辽宁省杨树研究所，辽宁盖州115213)

食用菌俗称“蘑菇”，是一类可供人类食用的大型真菌，鲜食美味可口，干菇有浓郁的香味，风味独特，有“素中之荤”的美名。食用菌富含蛋白质、氨基酸、维生素并兼具食疗价值。我国目前进行商业性栽培的食用菌种类大约有四五十种，但在产品名称上，经常发生商业名称、学名和俗名相互混淆和张冠李戴现象，甚至同物异名、同名异物[1]。做好食用菌菌种鉴定及种质资源保存，是保证食用菌良种在生产中发挥最佳栽培效果的主要措施之一，是相关研究人员应该尤为重视的工作。

食用菌的菌种鉴定目前采用的基本上是传统形态特征结合ITS(Internal transcribed spacer)序列分析来完成。 ITS是核糖体rDNA中介于18S与5.8S之间、5.8S与28S之间的内部转录间隔区，其保守性表现为种内相对一致，种间高度特异[2]。本研究通过 ITS序列分析方法对市售5种食用菌子进行分子鉴定，初步确定分类学地位，为食用菌种质资源提供了依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

供试真姬菇、杏鲍菇、蟹味菇、香菇和平菇购自辽宁省盖州市聚富市场，各食用菌形态见图1，分别标记为ZJG、XBG、XW、XG、PG。

图1五种常见食用菌子实体形态

从左至右依次为ZJG、XBG、XW、XG、PG

1.2 培养基

供试培养基采用PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，水1000mL，pH自然。称取马铃薯200g并切成1cm见方的小块，放入水中煮沸20～30min，用八层纱布进行过滤，过滤后加入葡萄糖、琼脂，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000mL，分装锥形瓶，121℃，0.15MPa高压灭菌20min，备用。

1.3 酶及生化试剂

TIANGEN DNAsecure新型植物基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；TaqDNA Polymerase购自Thermo公司；引物采用真菌通用引物ITS1、ITS4，由TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司合成。引物序列为：ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

1.4 试验方法

1.4.1 菌种分离。子实体用75%酒精轻轻擦拭2～3遍，在超净工作台中，将子实体沿菌盖中央轻轻掰开，用解剖刀在子实体菌柄与菌盖交界处取黄豆粒大的菌肉接种至PDA平板培养基中，每个平皿接种1块菌肉，用封口膜封口后置于25℃生化培养箱中进行暗培养，待菌落直径达到1cm后，挑取边缘新鲜菌丝进行转接纯化培养，转接2～3次，培养好的菌种置于4℃冰箱中存放。

1.4.2 菌丝DNA提取及凝胶电泳检测。菌丝25℃下静置培养7d后，刮取菌落边缘的新鲜菌丝，使用TIANGEN公司的DNAsecure新型植物基因组DNA提取试剂盒进行基因组DNA提取，具体操作方法按说明书进行，提取的DNA溶于TE中，并置于-20℃保存备用。取6μL提取的DNA经1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用Syngene G:BOX凝胶成像系统进行拍照。

1.4.3 ITS-PCR扩增及序列比对。以基因组DNA为模板，应用真菌通用引物对ITS1和ITS4进行PCR扩增，ITS-PCR扩增体系为：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，引物(10μmol/L)0.5μL，rTaqDNA 聚合酶(5U/μL)0.25μL，模板DNA 1μL，用ddH2O补足至25μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环，最后72℃延伸10min，终止温度在4℃。反应结束后取6μL产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测电泳结果，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送至TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司进行测序。测序结果登录GenBank进行BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)比对。

1.4.4 系统树构建。测序结果登录GenBank进行BLAST比对，找出与之最大相似性的序列，下载相似性序列的ITS区域，用Clustalw进行多序列比对，并辅以人工修正，分析时所有参数均为软件默认值。用MEGA 5.0软件采用N-J法构建系统发育树，进行系统发育分析，构建发育时进行自举检验，重复抽样1000次。

2 结果分析

2.1 菌丝DNA提取及ITS-PCR扩增

提取的DNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测(见图2)，PG、XBGDNA条带清晰、较明亮，无明显后拖尾现象，说明基因组DNA完整，可以作为PCR反应的模板。ZJG、XW和XG的DNA虽然有轻微拖尾，但DNA浓度较高，也可以作为PCR反应的模板。以提取的DNA为模板，ITS1、ITS4为引物对rDNA ITS区段进行PCR扩增，扩增结果显示各片段大小约为600～700bp(见图3)，与预期结果一致。

图2 DNA琼脂糖凝胶电泳图谱

M为DL 2000 DNA Marker；CK为水对照；1,2为PG；3,4为XBG；5为ZJG；6为XW；7为XG

图3 PCR产物电泳图

M为DL 2000 DNA Marker；CK为水对照；1～2为PG；3～5为ZJG；6～7为XB；8～10为XW；11为XG

2.2 序列比对及系统发育分析

rDNA ITS区段序列测定结果显示，各片段长度在620～751bp，具体比对结果如下，系统发育树见图4：

(1)XW序列测定结果显示， PCR扩增产物长度为628bp，测序结果登录GenBank经Blast比对，与XW同源性最高的菌株序列号分别为：JN234834.1、HM561968.1、JX046031.1、KP765747.1、JX046026.1等，相似性为99%，均为Hypsizygusmarmoreus。

(2)ZJG序列测定结果显示，PCR扩增产物长度为630bp，登录GenBank经Blast比对，与ZJG同源性最高的菌株序列号分别为：JX046031.1、JN234834.1、HM561968. 1、MH453612.1、KP765747.1等，相似性为100%，均为Hypsizygusmarmoreus。XW与ZJG比对之后菌种名相同。系统发育分析表明XW、ZJG与Hypsizygusmarmoreus(HM561968. 1)等聚为1支，置信度为87%，初步确定XW和ZJG为Hypsizygusmarmoreus。Hypsizygusmarmoreus(Peck) H.E.Bigelow又名Maki Mushroom，为真姬菇也叫姬菇、玉蕈、斑玉蕈，属担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、伞菌目(Agaricales)、白蘑科(Tricholomataceae)、玉蕈属(Hypsizygus)。真姬菇在日本称之为“蟹味菇”、“海鲜菇”。外形美观，质地脆嫩，味道鲜鲜，具有海蟹味，目前，栽培品种有浅灰色和纯白色2个品系，白色品系又称为“白玉蘑”。

(3)PG序列测定结果显示， PCR扩增产物长度为621bp，测序结果登录GenBank经Blast比对，与B6同源性最高的菌株序列号分别为：LN877896.1、MG840767.1、MG819736.1、MG819161.1、MG282484.1等，相似性为99%，为Pleurotusostreatus。系统发育分析表明PG与Pleurotusostreatus(登录号：LN877896.1)聚为一支，置信度为100%，初步确定PG为Pleurotusostreatus。Pleurotusostreatus中文名为侧耳，又名平菇、北风菌、青蘑、桐子菌、糙皮侧耳，属担子菌门、伞菌纲、伞菌目、侧耳科(Pleurotaceae)、侧耳属(Pleurotus)。

(4)XBG序列测定结果显示，PCR扩增产物长度为620bp，测序结果登录GenBank经Blast比对，与XB同源性最高的菌株序列号分别为：FJ572244.1、MG819740.1、MG2824890.1、MG282459.1、KY962500.1等，覆盖度100%，相似性为99%，为Pleurotuseryngii和Pleurotusfuscus。Pleurotusfuscus为杏鲍菇的异名之一[3]。系统发育分析表明XBG与Pleurotusfuscus(登录号：MG282459.1)等聚为一支，置信度为81%，初步确定XBG为Pleurotusfuscus。Pleurotusfuscus为杏鲍菇又名刺芹侧耳，属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属(Pleurotus)。

(5)XG序列测定结果显示，PCR扩增产物长度为751bp，测序结果登录NCBI经Blast比对，结果表明，与XG相似性最高的菌株序列号分别为：MH141994.1、MH856832.1、AB286067.1、AB286064.1、DQ467888.1菌种名称均为Lentinulaedodes，Query cover 98%～ 100%，ident均为99.46%～99.73%。系统发育分析表明XG与Lentinulaedodes(登录号：MH141994.1)聚为1支，置信度为99%，初步确定XG为Lentinulaedodes。Lentinulaedodes为香菇又名冬菇、香蕈、北菇、厚菇、薄菇、花菇、椎茸，是一种食用真菌。属伞菌亚门、伞菌纲、伞菌目、光茸菌科 (Omphalotaceae)、香菇属 (Lentinus)。

图4 五种食用菌系统发育树状图

3 结论与讨论

众所周知，食用菌子实体的发生和形态受外界环境条件影响很大，应用子实体形态对菌种进行鉴定存在一定的局限性。近年来随着分子生物学技术的发展，国际核酸数据库信息资源的不断丰富，ITS等分子鉴定手段逐渐被人们所关注。ITS核糖体rDNA内部转录间隔区序列通过与GenBank数据库进行BLAST检索比对，序列相似性≥99%，可以鉴别为相同种；序列相似性为95%～99%，可以鉴别为相同属[2]。ITS序列分析无论在无法人工栽培的菌根菌还是可栽培的常用食用菌鉴定中，应用越来越广泛，并在红菇[4]、鹅膏菌[5]、松乳菇[6]、卷边桩菇[7]、大肥菇[8]、蒙古口蘑[9]、硫磺菌[10]、深凹漏斗伞[11]等鉴定中成功应用。

本文结合ITS序列分析对市售常见的食用菌进行了分子鉴定，结果表明真姬菇和蟹味菇为玉蕈属的Hypsizygusmarmoreus， 平菇为侧耳属的Pleurotusostreatus，杏鲍菇为侧耳属的Pleurotusfuscus，香菇为香菇属的Lentinulaedodes。研究结果为进一步筛选优良菌种，提高产量，优化母种等研究提供了理论基础。