RLRs介导的抗鲤春病毒血症病毒作用研究进展

尚信池， 卢玉婷， 程 义， 代 静， 李月红

(吉林农业大学 动物科学技术学院 教育部动物生产及产品质量安全重点实验室，吉林 长春 130118)

在哺乳动物中，宿主细胞感染病毒会触发先天性免疫应答，其特征在于诱导干扰素(IFN)和下游IFN刺激基因(ISGs)参与免疫应答[1]。一旦病毒克服了物理和化学障碍，它将被宿主细胞的模式识别受体(PRRs)识别。在感染病毒期间，机体通过多种途径对RLRs介导的天然免疫进行复杂调控，产生一个病毒-RLRs-IFN互联反馈回路，确保RLRs维持适当的抗病毒信号水平[2]。大量研究表明，RNA病毒感染通常被宿主细胞质受体识别，即视黄酸诱导基因I样受体(RLRs)，DNA受体识别DNA病毒感染，如细胞内cGAS(环状GMP-AMP合成酶)、DAI(IRF的DNA依赖性激活剂，也称为ZBP-1)、IFI16(IFN-γ-诱导蛋白16)等[3]。在硬骨鱼中，病毒感染会激活宿主天然免疫IFN抗病毒反应信号通路[4]，其中RLRs信号通路起到重要作用，通路中涉及的关键信号分子，如RIG-I、MDA5、MAVS、MITA、TBK1和IRF3/7，已在许多鱼类中得到鉴定[5]。病毒感染后，鱼类的这些基因会显著诱导天然免疫应答，并且过度表达导致IFN和ISG的上调以及宿主抗病毒状态的建立[6-11]。此外，研究表明鱼类具有保守RLR途径以引发IFN表达和抗病毒反应。SVCV是一种负义单链RNA病毒，主要在鲤科鱼类中引起急性出血和传染性疾病，尤其是鲤[12-13]。由于其对鱼类的巨大伤害，SVCV感染的斑马鱼模型已被用于研究鱼类抗病毒免疫能力[14-15]，通过使用这种病原体模型，鱼类干扰素受体已经确定[16]。此外，通过研究感染SVCV的不同来源的鱼类细胞系，发现鱼类抗SVCV过程中IFN通常会被上调[17-19]。现已有研究证实，RLRs不仅可活化天然免疫抗病毒通路，还可增强适应性免疫效应，在控制病毒感染过程中发挥重要作用，现对RLRs信号通路及其抗病毒信号调节因子和抗SVCV免疫的研究进展进行综述。

1 RLRs家族

RLRs属于DEx D/H box helicase家族，为胞质PRRs[2]。RLRs家族包括维甲酸诱导型基因I(RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)及遗传学和生理学实验室蛋白2(LGP2)三个成员[20]，通常可识别胞质内病毒的RNA。

RLR通过中心DExD/H-box解旋酶结构域识别病毒RNA，随后通过N-末端募集结构域(CARD)将信号转导至下游分子。这种识别方式招募并激活下游衔接蛋白线粒体抗病毒信号传导(MAVS)，进一步导致丝/苏氨酸蛋白激酶(TANK-binding kinase 1，TBK-1)的激活。活化的TBK1反过来磷酸化并激活IFN调节因子IRF3/7(interferon regulatory factor，IRF)以诱导I型IFN产生和IFN刺激的基因(ISG)的表达以建立宿主抗病毒状态。IFN基因刺激物(STING，也称为MITA)，可以激活TBK1-IRF3/7-IFN[3]。线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)和MITA通过TBK1介导的磷酸化依赖性机制激活IRF3诱导Ⅰ型IFN及IFN刺激基因(ISG)的表达，诱发抗病毒天然免疫反应[4]。

动物在应对病毒感染时，入侵的病毒被RIG-I或者MDA5识别，再通过MAVS传递信息，随后TBK-1磷酸化干扰素调节因子IRF3和IRF5，最终激活IFN-Ⅰ的表达，调节天然免疫或者再激活下游细胞因子，发挥抗病毒作用[21]。LGP2则作为正调控因子参与RLR抗病毒信号通路。Zou等[22]研究鱼类RIG-I发现，当SVCV的感染复数(MOI)分别为0.1和1，转染的RIG-Ib过表达时，鲤上皮瘤(EPC)细胞上清液病毒滴度分别为1.88×104pfu/mL和2.23×103pfu/mL，与对照相比降低了70倍和1 082倍，并且RIG-Ib重组质粒(10 ng)EPC细胞中表达，导致I型IFN启动子活性显著增加。这些证据说明外源RIG-Ib能够强烈的诱导IFN-Ⅰ产生，以抵抗SVCV的感染。研究发现[23-24]，青鱼(black crop，bc)感染SVCV后，多个器官bcLGP2 mRNA表达上调，而MDA5只在肌肉和肾中表达量较高。体外实验q-PCR结果显示低剂量SVCV处理青鱼鳍条组织(MPF)细胞，可上调其bcLGP2和bcMDA5的转录。并且相比对照组，转染bcMDA5质粒的EPC细胞可以减弱SVCV感染造成的细胞病变效应(CPE)，细胞上清液中的病毒滴度也显著降低。同时也发现将表达bcMDA5和LGP2两种重组质粒共转染进EPC细胞，青鱼干扰素(eIFN)表达量比单独转染两种表达质粒时显著提高。以上结果说明LGP2和MDA5是细胞重要的抗病毒因子，LGP2与MDA5可共同识别SVCV的RNA，提高eIFN的表达，且LGP2增强MDA5介导抗病毒作用[25]。

2 RLRs抗病毒信号调控因子与IFN-I的产生

RIG-I，MDA-5和LGP2都识别核糖核酸。RIG-I做为病毒RNA胞质传感器的作用就是感知RNA病毒的感染。RIG-I主要识别5′端三磷酸化的单链RNA(ssRNA)和短双链RNA(dsRNA)模拟物如poly Ⅰ：C、poly Ⅰ：U等，而MDA5主要识别长dsRNA和包含ssRNA及dsRNA在内的RNA结构域。虽然能识别不同类型的病毒，但都需要适配子MAVS介导的固有免疫防御，并且需要共同合作来增强对正负链RNA病毒感染的有效应答。并且RIG-I和MDA-5还能通过MAVS诱导TRIM和TRAFs等适配子和细胞因子的信号传导[26]。诱导干扰素和促炎症细胞因子的产生，从而启动先天免疫应答并且调节随后的获得性免疫应答，增强机体抵抗病毒的能力。下面对几种调控因子在抗SVCV时产生的作用做一详细的综述。

2.1 MAVS

线粒体抗病毒蛋白(MAVS)作为一些信号通路的调控枢纽，具有招募调控下游细胞因子抗病毒的作用。Zhou等[27]研究发现，bcMAVS在青鱼组织内广泛表达，青鱼感染SVCV后，脾中bcMAVS表达下降，肌肉和肝部表达上调。体外实验中外源bcMAVS在EPC细胞中表达，以剂量依赖性方式诱导斑马鱼IFN启动子活性。Xiao等[28]研究发现，MAVS的跨膜结构(TM)和N-末端半胱天冬酶募集结构域(CARD)对其抗病毒和诱导IFN表达至关重要。在免疫荧光显微镜下观察到，感染SVCV后只有具有CARD和TM结构域的bcMAVS才能在EPC细胞线粒体中形成聚集体。荧光素酶报告基因测定显示bcMAVS在EPC细胞中表达，以剂量依赖性方式诱导斑马鱼IFN启动子活化并且呈正相关，而缺少CARD和TM结构域的bcMAVS对IFN的活化几乎没有影响。表达HA-bcMAVS重组质粒的EPC细胞，通过与对照组比较SVCV滴度和细胞病变效应指标，发现EPC细胞抗病毒能力提高。以上数据显示，MAVS的TM和CARD结构域对其招募下游细胞因子和自身聚集以发挥抗病毒作用至关重要，MAVS广泛存在于鱼体内，当病毒入侵时，通过招募其他细胞因子诱导IFN-I表达，发挥抗病毒作用。Gong等[1]研究表明，MAVS和MITA的显性失活突变体MAVS-ΔTM与MITA-CT的过表达削弱了SVCV对鱼类IFN启动子的激活。MAVS-ΔTM和MITA-CT的明显阻断作用可能是通过SVCV调节IRF3和双链RNA依赖的蛋白质激酶(PKR)的表达，因为MAVS-ΔTM表现出比MITA-CT更好的抑制作用。结果表明，鱼类MAVS和MITA都是SVCV触发的IFN表达所必需的。这些结果共同阐明了RLR介导的IFN信号传导的保守性，这有助于鱼类对RNA病毒感染做出反应。

2.2 STING

STING作为一种 IFN 刺激因子被发现，并在大量组织多种细胞中广泛表达，提示其在免疫调节方面可能具有十分重要的功能[29]。Lu等[30]研究发现，感染SVCV青鱼的bcSTING 在鱼体肾脏表达上升，在肝、皮肤、心脏、脾中表达下降。体外实验中，使用SVCV(MOI=0.1)处理青鱼(Mylopharyngodonpiceus)尾鳍细胞可以诱导bcSTING mRNA大量表达。在荧光素酶报告实验中，HA-bcSTING呈现出强烈的IFN诱导活性，bcSTING-HA却没有该能力。但两者分别转染EPC细胞表达后进行SVCV感染，都能减轻EPC细胞的细胞病变效应，显著降低细胞上清液的病毒滴度，使EPC细胞具有抗病毒能力。这些数据可推测，bcSTING对病毒核酸有一定的识别能力，其C端结构对诱导IFN活性至关重要。外源性bcSTING显著提高了EPC细胞对SVCV抗病毒能力，表明bcSTING在青鱼抗病毒先天免疫应答中起重要作用。

2.3 TRAF6

肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAFs)家族是一类胞内接头蛋白，能直接或间接与Toll样受体接合，也能激活NF-κB信号通路，在天然免疫过程中发挥重要作用。Jiang等[31]发现，bcTRAF6 mRNA在青鱼组织内广泛表达，感染SVCV青鱼的不同组织bcTRAF6 mRNA表达均上调，其中鳃、皮肤、肝脏显著上调。MPF细胞感染SVCV后bcTRAF6 mRNA表达显著上调，表达量最高为5.2倍(MOI=0.1，72 h point)。结晶紫染色法结果发现，转染并表达bcTRAF6的EPC细胞，在感染SVCV后，CPE和细胞上清病毒滴度跟对照组相似。同样在荧光素酶报告实验中发现EPC细胞转染并过表达bcTRAF6，对斑马鱼 IFN3和青鱼IFN没有影响，而外源bcTRAF6在青鱼肾(Mylopharyngodonpiceuskidney，MPK)细胞中以剂量依赖的方式触发NF-κB的转录。因此他们尝试将bcMAVS和bcTRAF6重组质粒共转染或单独转染EPC细胞，免疫荧光染色发现细胞质的bcTRAF6蛋白消失，在线粒体处与bcMAVS叠加在一起。使用荧光素报告实验测定证实了外源bcTRAF6可以通过其他途径介导MAVS来调节eIFN的表达。

2.4 TRAF2

TRAF2作为TRAF家族成员，参与NF-kB通路。Chen等[32]研究发现，bcTRAF2 mRNA在青鱼组织内广泛分布，感染SVCV后，鱼体心脏和鳃bcTRAF2 mRNA表达量下降，其他组织表达上调。使用不同浓度SVCV(MOI=0.01、0.1、1)处理MPF细胞，发现在48 h时，bcTRAF2 mRNA相对表达量显著提高，分别达到2.77、4.53、4.12倍。荧光素酶报告实验表明bcTRAF2过表达呈剂量依赖方式诱导NF-kB的转录，对斑马鱼IFN I的诱导几乎没有作用。空斑试验结果显示，表达bcMAVS和bcTRAF2的EPC细胞培养液中的病毒滴度，低于表达bcMAVS的EPC细胞，并且随着bcTRAF2剂量增加，SVCV滴度降低。以上数据证明单独的外源bcTRAF6或bcTRAF2都不能激活Toll样受体信号通路，更不能诱导IFN的表达以此提高EPC细胞的抗病毒能力，但都能激活NF-κB的转录，通过MAVS和NF-kB信号通路调节鱼类天然免疫发挥抗病毒的功能。

2.5 TRIM47

TRIM(The tripartite motif)家族的成员扮演着许多重要的角色，涉及许多细胞过程，如发育过程、肿瘤抑制、细胞周期调控和病毒反应[33]。TRIM 蛋白家族还调节NF-κB信号通路[34]。Wang等[35]证明了鲤TRIM47在抗病毒过程以及对IFN-I信号通路的调控起着重要的作用。qRT-PCR和Western blot结果表明，TRIM47在斑马鱼组织中广泛存在，在脑部、肝和肾中高度表达，并且发现感染SVCV的鲤所有组织SVCV-G基因结果呈阳性，其中鳃、肾、脾和肝中TRIM47 mRNA水平呈下降趋势，第7天恢复到正常水平。此外感染SVCV(MOI=0.1)胖头鱼(FHM)细胞内的TRIM47 mRNA显著下降，表达TRIM47重组质粒的FHM细胞感染SVCV后，发现SVCV-G基因转录水平明显低于对照组，IFN-I表达上调。以上结果可推断在正常情况下TRIM47在组织细胞内广泛存在并维持一定的水平，当抵抗SVCV病毒感染时，降低自身转录水平，以调节相关细胞因子，引起IFN-I的上调，激活鱼类天然免疫过程。

图1 RLR 介导的信号通路及其调节作用[36]

3 干扰素诱导的鱼类Mx蛋白

抗黏液病毒基因蛋白(Mx)是IFN诱导蛋白家族成员之一，当病毒入侵机体和细胞时，刺激干扰素表达，干扰素进一步诱导Mx蛋白和其他蛋白表达，一起构成细胞的抗病毒状态，起到抑制病毒作用。Børre等[39]通过系统发育对大西洋鲑基因组进行分析，定位于3条染色体的9个Mx基因。重组IFN刺激细胞系表达Mx基因，显示染色体12中的Mx基因对I型IFN的反应比对II型IFN(IFNγ)的反应更强，而染色体25中的Mx基因对IFNγ的反应比对I型IFN的反应更强。Mx蛋白严格依赖于IFN-I表达，通过中枢连接结构域(CID)和C端的亮氨酸拉链结构域结合病毒核衣壳样结构，发挥抗病毒功能[40]。该分子抗病毒功能首先由Jean Lindenmann在研究小鼠对流感病毒的先天免疫中发现[41-42]，Xiao等[43]进一步研究鱼类Mx的功能，克隆和表达青鱼Mx1(bcMx1)基因，发现bcMx1同样具有抗病毒的能力。使用RT-PCR检测发现青鱼组织中鳃中Mx1 mRNA含量远高于其他组织，感染SVCV后，鳃中bcMx mRNA下降。MPF细胞感染不同浓度SVCV后，q-RT-PCR检测，除了2 h(MOI=0.01)外Mx mRNA水平降低，其他组都表达上调，最高为133倍(72 h，MOI=0.01)。转染表达bcMx1的质粒EPC细胞显示出抗SVCV活性，CPE程度和细胞上清病毒滴度降低。综上，鱼类Mx蛋白具有抗病毒的能力，当SVCV入侵时，在细胞质内IFN-I表达上调，激活Mx基因的表达，参与抗病毒免疫过程。

4 展 望

随着水产养殖业的快速发展，人们对养殖过程出现的疾病的防治越来越重视，SVCV作为鱼类水产养殖中重要的病原体，研究宿主对SVCV的防御机制势在必行。RLRs信号通路作为天然免疫应答中的重要组成部分，在维持机体稳态平衡，激活天然免疫应答中发挥重要作用。天然免疫作为机体防御的最重要屏障，其研究已取得诸多进展。随着对天然免疫信号通路的深入研究，天然免疫应答对于入侵宿主病毒的抗病毒应答也有了突破性进展尤其在抑制病毒方面。从2004年RLRs被发现可以识别胞质内病毒RNA，RLRs的分子结构及调控机制就受到了广泛地研究。SVCV作为典型的RNA病毒，其感染有可能引发鱼类IFN抗病毒反应；然而，SVCV感染激活哪种信号传导途径以启动IFN应答仍有待研究。

近些年研究发现NLRs和RLRs在抗病毒信号传导之间也有一些特殊的联系，NLRs也同样参加I型IFN调控，与MAVS作用活化IRF3，诱导干扰素的产生，增强宿主抗病毒状态，但是怎样作用于MAVS还需进一步研究。现阶段对于SVCV抗病毒免疫应答的报道还相对较少，所以研究SVCV的抗病毒天然免疫应答可以为SVCV的防治、SVCV疫苗的研发奠定基础。除此之外，研究领域还可以扩展到SVCV基因调控，免疫逃避机制等，为SVCV的预防和控制提供新的策略。