河岸带内生烟曲霉的香豆素类抗氧化产物提高拟南芥抗涝害能力研究

高 媛, 曹 飞， 李 辉， 刘士平， 薛艳红

(三峡大学 生物与制药学院，湖北 宜昌 443002)

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、植物材料 烟曲霉SG-17(中国典型培养物保藏中心CCTCCM2015286)分离自疏花水柏枝根部，4 ℃石蜡保藏[23]；野生型拟南芥种子(Col-0)由三峡大学生物技术中心沈祥陵博士提供。

1.1.2 培养条件 SG-17菌种在PDA培养基28 ℃培养5 d后，接种到SDA液体培养摇瓶中(200 mL/500 mL)，28 ℃、140 r/min培养14 d后，提取分离。PDA及SDA培养基按照文献[23]介绍的方法进行配制。将拟南芥种子放入铺有湿润滤纸片的平皿中，4 ℃冰箱春化3 d，然后均匀点在被花宝溶液(3 g/L)浸湿的灭菌土壤(营养土∶蛭石= 1∶1)里，封上保鲜膜，放入植物培养室(20～22 ℃，16 h/8 h昼夜交替，光照强度为120～150 μmol·m-2·s-1)，3～5 d后摘掉保鲜膜，生长4周后获得实验苗。

1.1.3 仪器与试剂 电子天平(BS-224s，德国赛多利斯)；不锈钢智能型立式灭菌锅(YM30F，上海三申医疗器械有限公司)；干燥箱/培养箱(PH-030A，上海一恒科学仪器有限公司)；双人净化工作台(SW-CJ-2FD，苏州净化设备厂)；台式恒温振荡培养箱(ZQZY-85BN，上海知楚仪器有限公司)；薄层色谱展开缸(上海信谊仪器厂有限公司)；三用紫外分析仪(ZF-6，上海嘉鹏科技有限公司)；紫外可见光分光光度计(752(N)，上海佑科)；旋转蒸发器(BC-R203，上海贝凯生物化工设备有限公司)；核磁共振波谱仪(400 MHz，德国Bruker公司)；PCR仪(MyCycler，美国BIO-RAD公司)；凝胶成像系统(GDS-8000，美国UVP公司)；水平电泳仪(DYCP-31DN，北京市六一仪器厂)；离心机(LD4-2A，北京医用离心机厂)；电热恒温水槽(DK-8A，上海精宏实验设备有限公司)；超低温冷冻冰箱(DW86L386，Haier)； 微量移液枪(Eppendoff，德国)；qRT-PCR仪(CFX96TMOptics Module)。丙二醛(MDA)测试盒和超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所，ADHELISA检测试剂盒购于科诺迪生物公司，EASYspin 植物RNA快速提取试剂盒(艾德莱生物公司)。SYBRII购自TakaRa公司，1st-Strand cDNA合成试剂盒(GenStar 公司)。

1.2 方法

1.2.1 抗氧化活性物质的结构解析 将在SDA培养14 d的SG-17进行真空抽滤，收集发酵液，等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，42 ℃、0.1 MPa下旋蒸为发酵液酯相初提物，薄层层析分离发酵液酯相初提物(展开剂为V(石油醚)∶V(丙酮)=1∶1)，经抗氧化活性跟踪，确定活性最强片段，将其进行半制备HPLC制备，色谱分离纯化条件,流动相：V(乙腈)∶V(水)= 60∶40，流速3.0 mL/min，紫外检测波长254 nm，分析柱为Cosmosil MS-II RP-C18色谱柱。将得到的单体化合物冷冻干燥后用二甲基亚砜(DMSO)溶解，核磁共振(600 MHz，DMSO-d6)鉴定其结构。单体的抗氧化活性采用总抗氧化能力(T-AOC法，南京建成生物工程研究所)进行测定[23]。

1.2.2 拟南芥水淹胁迫及生理参数测定 用不同浓度的NFA(1、10、100 μg/mL)和正对照水杨酸(SA， 1、10 μg/mL)处理4 h后，全淹法水淹4 d，正常生长2周后统计生长状况，每盆6株苗，每个处理3次重复，生长条件同1.1.2。硫代巴比妥酸法(TBA)测定体内 MDA的含量[25]，氮蓝四唑还原法测定SOD的含量[25]，双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法测定ADH的含量[25]，具体操作见试剂盒说明书。

1.2.3 基因表达分析 将浓度为1 μg/mL的NFA分别处理拟南芥幼苗1、2、4、6 h，水淹4 d后将大小均一的3～4片叶，用蒸馏水清洗净、吸水纸吸干后置于液氮中，用EASYspin 植物RNA快

表1 引物序列

速提取试剂盒提取RNA，合成cDNA，具体操作见试剂盒说明。实验所用引物(上海生物工程公司合成)序列见表1。将合成的cDNA母液稀释5倍，取1 μL加入10 μL SYBII、F和R引物各0.5 μL、ddH2O 8 μL配置成20 μL试验液，加入到96孔板中，封上MicroAmp透明胶膜，以Actin 作为内标，于qRT-PCR仪中扩增30～40个循环后进行数据处理[26]。

1.2.4 数据处理 本研究使用数据分析软件SPSS 20.0，采用单因素方差分析(oneway ANOVA)和最小显著性差异法(LSD)进行显著性分析，用graphpad prism 5软件作图。

2 结果与分析

2.1 抗氧化活性物质结构解析

前期我们报道了内生烟曲霉SG-17的抗氧化活性，发现其主效成分与绿原酸有类似的波谱特征[23]。为进一步测定该物质的结构，通过抗氧化活性追踪和HPLC分析与制备，收集到一浅黄色固体化合物，其总抗氧化活性(T-AOC)高达131.94 U/mL，是同等浓度下维生素C的18倍。

将该物质冷冻干燥后用DMSO溶解，经核磁共振分析获得以下波谱数据：1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6) δH6.64 (d，J=9.8 Hz，1H，H-1)，5.60 (d，J=9.8 Hz，1H，H-2)，7.19 (d，J=8.3 Hz，2H，H-2′/6′)，6.77 (d，J=8.3 Hz，2H，H-3′/5′)，8.10 (s，1H，-CHO)，9.83 (brs，1H，NH);13C-NMR (150 MHz，DMSO-d6) δC118.2(CH，C-1)，111.3 (CH，C-2)，126.5 (qC，C-1′)，130.1 (CH，C-2′/6′)，116.0 (CH，C-3′/5′)，156.8 (qC，C-4′)，160.5 (CH，-CHO)。经数据库检索，与文献报道的(Z)-N-(4-羟基苯乙烯基)甲酰胺(NFA)一致[27]，证实了该物质与绿原酸同属香豆素物质，分子式为C9H9NO2(图1)。

图1 NFA的结构鉴定

2.2 NFA可有效协助拟南芥抵抗水淹胁迫

前期研究表明，SG-17的抗氧化活性粗提物可以有效协助水稻抵抗干旱胁迫[24]。由于该菌的宿主疏花水柏枝经常生活在一种淹水的环境中，为了证实SG-17的代谢产物是否能提高植物的耐淹能力，本研究以拟南芥为试验材料，用不同浓度的NFA进行处理，评价其对水淹的效果。首先比较了拟南芥在全淹1、2、4、6 d的生长状况，结果发现，在水淹4 d的条件下，拟南芥可以正常生长，但其长势与株高明显弱于正常生长的幼苗，故选择4 d的全淹条件来评价NFA对水淹的影响。

图2 NFA对拟南芥耐水淹能力的影响

将拟南芥的幼苗喷洒不同浓度的NFA后再进行水淹处理，结果发现其长势明显优于对照(图2)。浓度为1 μg/mL时，添加了NFA的幼苗生长优于对照(图2A、B)，NFA为100 μg/mL下(图2D)，水淹后的幼苗生长接近正常生长水平(图2E)。需要指出的是，在相同浓度下，NFA的效果均优于正对照水杨酸(图2B、C和图2G、H)，说明NFA有效地提高了拟南芥耐水淹的能力。

2.3 NFA对拟南芥水淹生理的影响

当植物在遭受水淹等逆境胁迫时，由于ROS的影响，使得MDA、SOD、ADH等物质的含量常出现变化，因此这些参数是评价逆境胁迫程度或逆境抵抗能力的重要指标[24]。为了研究NFA对拟南芥水淹的生理影响，本研究测定了NFA在处理不同时间后MDA、SOD和ADH的含量变化。结果表明，随着水淹时间的延长，拟南芥体内MDA、SOD和ADH的含量均发生显著性下降(P<0.01)，在水淹4 d时，MDA含量下降了51.83%，SOD含量下降了42.92%，ADH含量下降了11.76%(图3)。但是在拟南芥的正常生长条件下，用浓度为1 μg/mL的NFA处理一段时间后，发现除了ADH下降外，MDA、SOD含量均明显上升，其中NFA作用4 h时达到最大，分别增加了55.43%和15.79% (图4)，显示NFA可以影响植物体的氧化胁迫水平。

拟南芥在水淹后上述抗氧化指标也显著增加，MDA、SOD、ADH的增量分别达到64.55%、88.07%和4.48%(图5)。值得一提的是，NFA在淹水后对上述抗氧化指标的影响明显高于淹水前，特别是SOD，淹水前只提高了15.79%，淹水后却达到88.07%，增量差异接近5倍(图5)，接近正常生长(水淹前)水平，说明NFA的处理可以有效缓解淹水胁迫。同时，拟南芥在正常生长时NFA会使ADH呈下降趋势，而在淹水胁迫4 d后，ADH的含量会明显增加(图5)，减缓了因水淹造成的ADH的下降(图3)，提示NFA参与拟南芥淹水后的ROS代谢和氧化胁迫过程。

图3 水淹环境下拟南芥体内MDA、SOD和ADH的含量

图4 NFA处理后拟南芥体内MDA、SOD和ADH的含量

图5 NFA对水淹下拟南芥体内MDA、SOD和ADH含量的影响

图6 水淹条件下Atrbohs家族的表达分析

2.4 NFA对拟南芥Atrbohs基因家族的表达分析

NADPH氧化酶是ROS产生的关键酶，影响着植物的水淹胁迫能力[10]。在水稻中的研究表明，SG-4的提取物可以提高NADPH氧化酶的酶活从而提高其抗旱能力[24]。有研究表明，拟南芥的atrbohD和atrbohF突变体，对低氧胁迫都非常敏感[28]。为明确NFA是否影响拟南芥NADPH氧化酶的表达，本研究采用qRT-PCR方法分析了不同水淹条件下NFA对Atrbohs基因家族AtrbohA～AtrbohJ的表达影响。结果显示，淹水4 d后AtrbohD和AtrbohF基因的表达发生显著下调(P<0.01)，而其他基因变化趋势不明显(图6)，提示这两个基因可能是拟南芥参与水淹胁迫代谢的主要NADPH氧化酶，这与文献报道的AtrbohD和AtrbohF基因调节拟南芥的低氧耐受能力一致[28]。

为了证实NFA是否影响AtrbohD和AtrbohF的表达，用1 μg/mL的NFA处理拟南芥后进行RT-PCR分析，结果发现AtrbohD基因的表达显著上升(P<0.01)，作用4 h时最为显著，提高了近3倍(图7A)。可NFA对AtrbohF的表达发生了抑制，作用4 h时下调率达到88.6%(图7B)。相应地，在水淹胁迫处理后，NFA使得AtrbohD基因的表达发生轻微上调(图7C)，可AtrbohF的表达却得到部分程度的恢复，在不添加NFA的淹水条件下，降低65.4%，添加NFA后只下降了19.9%(图7D)，说明NFA可能通过影响AtrbohD和AtrbohF的表达来提高拟南芥的抗水淹胁迫能力。

图7 NFA作用下AtrbohD和 AtrbohF在水淹前后的表达

3 讨 论

近年来有很多关于内生菌协助宿主提高生境适应性的报道[18]，但是关于对植物抗水淹能力的报道却比较少见。本研究从化学生态学的角度，报道了一种河岸带植物疏花水柏枝的内生烟曲霉SG-17，可以通过产生一种香豆素类抗氧化产物NFA，影响拟南芥的抗氧化代谢并提高其抗水淹胁迫的能力，丰富了在水淹胁迫下植物与体内内生菌的共生关系理论，为提高植物的生态适应性及抗涝害能力奠定了基础。

NFA可能通过调节AtrbohD和AtrbohF的表达来提高植物的抗淹水能力，但两者的作用方式可能并不相同。水淹会导致AtrbohD的表达下调，但这种下调趋势将受到NFA的抑制(图6和图7)。而AtrbohF的表达更为复杂，虽然水淹和NFA处理都会导致其下调(图6和图7)，但并不能说明NFA是促进水淹胁迫的，因为处理的时间有差异，淹水处理采用的是0～6 d，而NFA处理是0～6 h。从图6可以看出，AtrbohF基因在水淹1 d时表达显著上升，而添加NFA则会显著抑制其表达(图7)。上述结果说明AtrbohD和AtrbohF基因对植物抗水淹的作用途径可能不一样，可能与水淹的时间长短有关，但不管是哪种途径，NFA都可以抵消由水淹胁迫导致的基因表达变化，从而提高拟南芥对水淹的耐受能力。

Atrbohs是一种直接产生ROS的NADPH氧化酶基因家族[7]。本研究却发现近乎于悖论的地方：内生菌的香豆素类似物NFA，一方面作为抗氧化剂可以降低ROS的含量，另一方面却提高体内NADPH 氧化酶的活性来增加ROS的含量。究其原因，可能是由于ROS对植物抗水涝胁迫的双重调节能力所致，这在某种程度上反映了内生真菌可以双向调节植物体内的氧化平衡，从而提高植物的抗水分胁迫能力，即一方面可以促进ROS 的产生以提高对胁迫的响应，另一方面可以清除ROS 降低氧化胁迫水平，从而使得植物体的氧化水平趋于动态平衡状态。

有文献报道，MDA、SOD、ADH等生理参数的变化与植物品种、抗胁迫能力及胁迫强度有关[25]。MDA是氧化损伤的产物，一般在胁迫初期含量会增加，但随着胁迫时间的延长，含量呈下降趋势[25]，添加NFA可以有效抑制这种下降趋势(图3)。正常生长中，添加NFA后会导致ADH含量下降(图4)，可是水淹后NFA显著提高了ADH的含量(图5)。另外，在正常生长下，NFA有轻微的促进拟南芥生长的能力(图2E、F)，但是相关生理参数和基因表达分析表明，NFA对拟南芥水淹胁迫后的影响更为明显，说明NFA更倾向于作为一种抗胁迫物质而不是促生物质在发挥作用。

内生菌SG-17的天然宿主是疏花水柏枝，但是由于它本身就是一个耐淹物种，而且其组培和再生体系比较复杂，难以获得不带内生菌的无菌苗，故本研究未能对NFA是否有助于天然宿主提高抗水淹能力展开探讨，在后期的研究中需要进一步完善。本研究中所有生理参数和基因表达数据都提示NFA通过影响ROS的合成来发挥作用，未来的研究将集中在NFA对植物不同部位ROS的瞬时定量开展研究，同时对NADPH氧化酶的抑制剂及相关突变体进行探讨，以期进一步揭示NFA提高植物耐淹的分子机制。