不同剂量米非司酮对子宫内膜异位症大鼠异位内膜组织中环氧合酶-2和血管内皮生长因子表达的影响

南 燕，侯妍妍，李玉洁

(新乡医学院第三附属医院妇产科，河南 新乡 453003)

子宫内膜异位症是生育期女性常见的妇科疾病，生育年龄大、生育次数少者多发，绝经后使用激素替代治疗者也有发病，患者多以慢性盆腔痛、性交痛、不孕、月经失调等为主要临床表现[1]，给生育期女性带来了严重困扰。子宫内膜异位症的发病机制尚不明确，可能与基因、新生血管形成、炎症反应、氧化应激、免疫和子宫收缩异常等有关[2]。目前，临床医生多主张尽量给予药物治疗，但临床上治疗子宫内膜异位症的药物繁多，只有彻底明确药物的作用机制，才能保障用药安全性和合理性。本研究选取造模成功的子宫内膜异位症大鼠作为研究对象，观察不同剂量米非司酮对子宫内膜异位病灶及异位病灶中环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物选取8周龄健康清洁级雌性Sprague Dawley大鼠120只，体质量200～220 g，由新乡医学院实验动物中心提供，确认均为发情期的性成熟大鼠。

1.2 药物、试剂与仪器米非司酮药粉剂(上海麦克林生化科技有限公司)，放射免疫沉淀(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、 二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒(北京鼎国昌盛生物有限责任公司)；组织切片机(浙江金华市科迪仪器有限公司)，JY92-II超声波细胞粉碎机(上海新芝生物技术研究所)，DG-300C电泳仪(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)。

1.3 子宫内膜异位症模型大鼠制备及分组SD大鼠采用100 g·L-1水合氯醛腹腔麻醉后在尿道口上方腹部做切口，切取部分子宫，置于生理盐水中，将子宫内膜与肌层分离后，取5 mm×4 mm的内膜组织将其缝于切口边缘内侧血管丰富的腹壁上，4周后再次开腹，在腹壁下发现颜色异常的浆液性水疱或质硬团块组织，并经病理组织学证实为存活的异位内膜组织，说明建模成功。选取112只建模成功的大鼠随机分为模型组及低、中、高剂量米非司酮组，每组28只。模型组大鼠给予1 mL花生油灌胃，每日1次，共4周；低、中、高剂量米非司酮组大鼠分别按1.04、1.24 2.60 mg·kg-1给予米非司酮混悬液灌胃，每日1次，共4周。低、中、高剂量对应临床用药分别为10.0、12.5、25.0 mg·d-1，根据实验动物学药物计算公式换算得出低、中、高剂量米非司酮组大鼠用药剂量分别为1.04、1.24、2.60 mg·kg-1。米非司酮混悬液由米非司酮原药粉加入花生油中形成，质量浓度为1 g·L-1。

1.4 各组大鼠异位内膜组织体积测量模型建立成功后，麻醉大鼠开腹测量大鼠异位内膜组织长、宽、高，根据体积=0.52×长(mm)×宽(mm)×高(mm)[3]，计算异位内膜组织体积。灌胃治疗 4 周后，再次剖腹测量并计算异位病灶体积，同时取异位病灶组织，于-80 ℃冻存待用。

1.5 Western blot检测大鼠异位内膜组织中 COX-2和VEGF蛋白表达将米非司酮干预后所取异位内膜组织碎块于冰块上粉碎，加入细胞组织快速裂解液及苯甲基磺酰氟，裂解粉碎，4 ℃下12 000 r·min-1离心10 min，提取组织蛋白，以二喹啉甲酸法进行蛋白定量，制胶，电泳，转膜，封闭，逐步加入一抗、二抗孵育后曝光鉴定，对胶片进行扫描，结果采用Quantity One分析软件进行分析，以β-actin 为内参，计算COX-2、VEGF蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组大鼠异位内膜组织体积比较结果见表1。模型组大鼠治疗后异位内膜组织体积与治疗前比较差异无统计学意义(P>0.05)；低、中、高剂量米非司酮组大鼠治疗后异位内膜组织体积均小于治疗前，差异有统计学意义(P<0.05)。治疗前各组大鼠异位内膜组织体积比较差异均无统计学意义(P>0.05)；治疗后，低、中、高剂量米非司酮组大鼠异位内膜组织体积均小于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；中、高剂量米非司酮组大鼠异位内膜组织体积小于低剂量米非司酮组，差异有统计学意义(P<0.05)；高剂量米非司酮组大鼠异位内膜组织体积小于中剂量米非司酮组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 4组大鼠异位内膜组织体积比较

注：与模型组比较aP<0.05；与低剂量米非司酮组比较bP<0.05；与中剂量米非司酮组比较cP<0.05。

2.2 4组大鼠异位内膜组织中COX-2、VEGF蛋白相对表达量比较结果见表2和图1。治疗前各组大鼠异位内膜组织中COX-2、VEGF蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠治疗后异位内膜组织中COX-2、VEGF蛋白相对表达量与治疗前比较差异无统计学意义(P>0.05)；低、中、高剂量米非司酮组大鼠治疗后异位内膜组织中 COX-2、VEGF蛋白相对表达量均低于治疗前，差异有统计学意义(P<0.05)。低、中、高剂量米非司酮组大鼠异位内膜组织中COX-2、VEGF蛋白相对表达量均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；中、高剂量米非司酮组大鼠异位内膜组织中COX-2、VEGF蛋白相对表达量低于低剂量米非司酮组，差异有统计学意义(P<0.05)；高剂量米非司酮组大鼠异位内膜组织中COX-2、VEGF蛋白相对表达量低于中剂量米非司酮组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 4组大鼠异位内膜组织中COX-2、VEGF蛋白相对表达量

nCOX-2VEGF28 0.610±0.012 0.618±0.023 0.608±0.0330.610±0.03128 0.613±0.0460.604±0.041 0.487±0.030ab0.485±0.028ab28 0.606±0.0320.624±0.036 0.427±0.027abc0.420±0.024abc28 0.609±0.0360.615±0.086 0.384±0.020abcd0.356±0.023abcd

注：与治疗前比较aP<0.05;与模型组比较bP<0.05;与低剂量组比较cP<0.05；与中剂量组比较dP<0.05。

A:模型组；B：低剂量米非司酮组；C：中剂量米非司酮组；D：高剂量米非司酮组。

图1 4组大鼠异位内膜组织中COX-2、VEGF蛋白表达(Western blot)

Fig.1 Expression of COX-2 and VEGF protein in endometriotic tissues of rats among the four groups(Western blot)

2.3 各组大鼠异位内膜组织中COX-2与VEGF蛋白表达的相关性Pearson相关性分析结果显示，异位内膜组织中COX-2与VEGF蛋白表达呈正相关(r=0.782，P<0.05)。

3 讨论

米非司酮用于治疗子宫内膜异位症已有20多年，其能改善患者盆腔疼痛，并使异位病灶萎缩。LI等[4]研究证实，米非司酮可降低子宫内膜异位症大鼠异位内膜组织中COX-2基因转录，从而降低前列腺素分泌。徐妍等[5]研究显示，米非司酮可抑制子宫内膜异位症大鼠异位内膜组织内炎性因子、侵袭基因、凋亡抑制基因的表达，同时增加促凋亡基因的表达。临床上将米非司酮单独或联合其他药物用于治疗子宫内膜异位症，但是关于剂量的选择目前尚无统一定论，临床用药剂量为5～25 mg，均无明确标准说明治疗的最佳剂量。张晓平[6]认为，腹腔镜手术联合米非司酮治疗子宫内膜异位症的疗效较理想，且安全性高。冯珀霖等[7]研究显示，醋酸曲普瑞林治疗子宫内膜异位症的作用优于米非司酮，其能够降低复发率，但是潮热、围绝经期症状、胃肠道反应等不良反应明显多于米非司酮，临床长期用药应慎重考虑。还有学者采用米非司酮联合孕三烯酮[8]、米非司酮联合中药[9-12]等方案治疗了宫内膜异位症，结果显示，这些治疗方案均能有效改善患者症状，减轻盆腔疼痛，降低术后复发率，且不良反应轻。

COX-2是一种膜结构蛋白，能将花生四烯酸代谢为各种前列腺素产物，可被多种生长因子、细胞因子、脂多糖、肿瘤启动因子等诱导产生。VEGF与多种肿瘤及炎症疾病的发生有关，VEGF在子宫内膜异位症的发生中参与新生血管内皮细胞增殖，促进新生血管形成[13-14]，与子宫内膜异位症的发病、进展有关。秦江霞等[15]研究显示，COX-2、VEGF在子宫内膜异位症患者异位内膜组织中高表达，与子宫内膜异位血管的生成有关。JANA等[16]研究发现，基质金属蛋白酶-2可通过环氧化酶2-前列腺素E2-磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶途径参与血管细胞迁移和侵入，在子宫内膜异位症发病中起着重要作用。

本研究结果显示，米非司酮治疗后，大鼠体内异位内膜组织体积较治疗前明显减小，异位子宫内膜组织中COX-2、VEGF蛋白表达明显降低；且给药剂量越高，上述各指标下降越明显。本研究还发现，异位子宫内膜组织中COX-2、VEGF蛋白表达呈正相关。米非司酮可能通过抑制雌激素和炎性因子的产生减少COX-2生成，阻止异位内膜组织中新生血管生成来抑制疾病进展。有研究发现，低剂量米非司酮(6.25 mg)与高剂量米非司酮(12.50 mg) 治疗子宫内膜异位症的效果相当，但服用小剂量米非司酮患者发生恶心、呕吐、头晕、皮疹等不良反应者较少[17-18]。陈勇[19]采用不同剂量米非司酮治疗腹腔镜下子宫内膜异位症患者病灶清除后的患者，结果发现，小剂量米非司酮组(6.3 mg)患者的症状缓解率和复发率均优于大剂量米非司酮组(12.5 mg)，且对患者体内激素水平的影响小于大剂量米非司酮组。杨其伟[20]也探讨了不同剂量米非司酮治疗子宫内膜异位症的临床疗效，结果发现，不同剂量米非司酮对子宫内膜异位症患者均有较好疗效，但低剂量米非司酮对患者内分泌水平影响更小，长期应用不影响患者骨密度。

总之，本研究结果显示，高剂量米非司酮治疗子宫内膜异位症可取得更好的疗效，但其是否会带来相关不良反应尚需进一步研究。