不同储藏年限稻谷的微生物群落代谢功能特性分析

葛志文 高瑀珑 刘 慧 郑云飞 邱伟芬

(南京财经大学食品科学与工程学院；江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，南京 210023)

作为世界上最大的稻谷生产国和消费国，我国稻谷种植面积广阔，且稻谷储藏的安全与防控问题一直备受关注。稻谷的储藏期一般为3年，储藏过程中，微生物在适宜的环境条件下滋生，容易引起储藏稻谷发霉、腐烂和变色，直接或间接地影响储藏稻谷的质量和安全[1]。平板计数法、菌落形态特征观察和菌种鉴定技术常被使用，然而这些方法存在操作规程复杂、分析耗时、低精度和低重复性等缺点[2]。为了评估储藏稻谷中微生物污染情况，本研究采用一种BIOLOG ECO平板生物学方法来评估储藏稻谷中微生物污染状况，具有重要意义。

BIOLOG ECO平板法的原理在于：由于微生物的种类和数量与微生物群落的代谢功能密切相关，因此通过四唑染色测定法对微生物群落代谢功能特性进行分析。该测定法根据四唑盐类由原初氧化态转变为还原态时呈现的明显颜色变化，实现快速表征储藏稻谷中微生物群落状况[3]。BIOLOG ECO平板法在很多研究中已有应用，如用于研究沉积物[4]、废水[5]、活性污泥[6]和土壤等[7]。此类平板上有96个微孔，每32个微孔为一个生物学平行，每板共计3个生物学平行。每个平行中除对照孔外各个孔内都含有一种不同的单一碳源和相同含量的四唑紫染料。群落中微生物在利用碳源的过程中产生自由电子，与四唑紫染料反应发生氧化还原反应，产生颜色变化，孔的吸光度变化反映了微生物对碳源的利用程度，即反映了环境样品微生物群落的代谢功能特性。不同微生物类群利用碳源的能力不同，产生的不同吸光度变化即可表征微生物群落差异[8]。

但是，在稻谷储藏领域，目前对微生物群落水平代谢功能性的研究很少。在本研究中，利用BIOLOG ECO平板对储藏稻谷微生物群落的代谢功能特性进行了分析，探讨了不同储藏期限与储藏稻谷微生物群落之间的关系，为稻谷安全储藏与防控提供一种新方法。

1 材料与方法

1.1 材料

稻谷样品依照三层五点法(粮库上、中、下三层，每层四个角落和中间设为采样点)从安徽省现代粮食物流中心库采集，包括未储藏、储藏1年、储藏2年和储藏3年四种样品，四种稻谷样品均来自相同地域。稻谷样品在温度(20±5)℃和相对湿度(50±5)%的粮库常规储藏条件下进行储藏。取样后，每种样品每层每点称量10 g，混合均匀，制得150 g的混合样品，分别标记为S0、S1、S2和S3，在均质袋中4 ℃保藏。

1.2 仪器

SF-CF-2A超净工作台；VOSHIN-600R无菌均质机；ES-08B电子天平；BIOLOG ECO平板；SpectraMax M2e多功能酶标仪。

1.3 方法

1.3.1 样品处理与平板加样

分别称取25.00 g稻谷样品于250 mL三角瓶中，加入225 mL 0.85%无菌生理盐水，在4 ℃以200 r/min振荡浸提1 h，静置3 min后分别将样品梯度稀释至10-2倍，每个样品做三个平行，将三个平行的菌液混合均匀后，用8道加样枪吸取150 μL至 BIOLOG ECO平板的微孔中，在25 ℃下培养，每隔24 h用酶标仪在590 nm(颜色+浊度)和750 nm(浊度)读取数据。

1.3.2 AWCD值的计算

BIOLOG ECO平板上的平均吸光度变化值(AWCD)用以衡量微生物利用不同碳源的能力，通常经过对一系列单时间点的AWCD值变化趋势，以及样品间AWCD值单因素方差分析来比较样品间微生物群落代谢特性的不同。一般认为AWCD值较大的样品具有较高的碳源利用能力，也往往具有较高的微生物丰度。某时刻平板内平均色度的计算公式为:

(1)

式中：Ci为不同时刻除对照孔外的各反应孔在590 nm和750 nm下的吸光度差值，R为对照孔在590 nm和750 nm下的吸光度差值，n为碳源数。Ci-R小于0.06的孔计算时记为零[9]。

1.3.3 多样性指数的计算

除AWCD值之外，多样性指数的计算也是一种常用的单时间点计算单一数值指标的方法。依照度量动植物多样性的思想，Zak[10]等提出基于BIOLOG ECO微平板的功能多样性指数的计算方法。

1.3.3.1 Shannon-Wiener多样性指数(H′)

H′=-∑PilnPi

(2)

Pi=(Ci-R)/∑(Ci-R)

式中:Pi为每一孔吸光度除以所有孔吸光度的和。通过(Ci-R)与除法对变量进行标准化，消除在点样及培养过程中对吸光度变化带来的影响误差。

1.3.3.2 Shannon均匀度指数(E)

E=H′/lnS

(3)

式中：S为微生物可以利用的碳源数目，即颜色有变化的孔数。

1.3.3.3 Simpson 多样性指数(D)

D=1-∑Pi2

(4)

1.3.3.4 McIntosh多样性指数(U)

(5)

式中：ni为第i孔的相对吸光值(Ci-R)。

1.3.3.5 McIntosh均匀度指数(E)

(6)

式中：S为颜色变化的孔的数目，N是相对吸光度值总和。

以上指数均表征微生物群体利用碳源能力的多样性，同普通生态学中多样性指数含意。

1.3.4 主成分分析(PCA)

本研究两种基于对单一数值的比较方法具有方便直观的特点，但由于这种计算方法不考虑碳源的分布方式，无差异的对待不同碳源产生的数据，与样品真实情况产生差异，因此本研究也从多维数据角度进行分析。

一个BIOLOG ECO微孔板上含有31种碳源类型，其中分为羧酸类、碳水化合物类、氨基酸类、聚合物类、双亲化合物类和胺类。为避免微生物群落代谢差异对统计分析结果产生影响，利用对采集的吸光度数据进行标准变换后获得的Rsi值进行PCA分析。

Rsi= (Ci-R) /AWCD

(7)

式中：Ci为不同时刻除对照孔外的各反应孔在590 nm下的吸光度值；R为对照孔的吸光值。

经过BIOLOG ECO平板培养第9天后，储藏稻谷的微生物群落代谢功能达到稳定期，选取该时间点的吸光度值进行主成分分析，得出的结果更为接近储藏稻谷微生群落代谢功能的真实状态。采用SPSS 19.0和Origin 8.5软件进行分析与作图。

2 结果与分析

2.1 不同储藏年限稻谷微生物群落在培养期间内平均色度变化率

AWCD(Average well color development，平均色度变化率)是反映储藏稻谷微生物群落代谢活性，即微生物利用单一碳源能力的重要指标[11]。在试验中，应用BIOLOG ECO生态微板在单时间点上计算单个值(AWCD)来确定碳源的代谢率，更准确地对储藏稻谷微生物群落的碳源代谢活性与多样性进行比较。根据式(1)，绘制本研究中不同储藏年限稻谷样品微生物群落利用总碳源的AWCD变化曲线，如图1所示。

图1 不同储藏年限稻谷AWCD随时间的变化

结果显示，四种不同储藏期限稻谷微生物群落的AWCD值在培养第1天均处于延滞期。从第2天起，AWCD值均呈现明显增加趋势并持续升高，表明微生物群落开始在平板上代谢利用有机碳源物质。选择4种样品第1天到第9天的AWCD值进行代谢活性分析，在这段期间内的斜率代表微生物群落代谢的平均速率。AWCD值的增加速率在第3天以后越来越小，在培养第9天，AWCD值变化达到相对稳定状态，表明微生物群落中可培养微生物在培养期内利用碳源的功能相对稳定。

未储藏新鲜稻谷(S0)的AWCD值明显高于其他储藏年限的稻谷，从0增加到0.969 8。储藏1年稻谷的微生物群落代谢速率最小，从0增加到0.731 3，表明稻谷在未储藏期，其微生物群落代谢功能最旺盛，而储藏1年后，稻谷的微生物群落代谢功能明显小于其他储藏年限的稻谷。在储藏期，储藏稻谷中微生物群落的代谢功能呈现出先减小后增加的趋势，在储藏1年后微生物群落代谢功能达到最低，其后随着储藏时间的增加，微生物群落利用碳源的能力逐渐增加。以上结果分析可得，不同储藏年限稻谷微生物群落间的代谢功能多样性存在差异，且未储藏的稻谷微生物群落与储藏一定期限的稻谷微生物群落间存在差异。

2.2 不同储藏年限稻谷微生物群落利用不同种类碳源的动力学特征

根据化学基团的性质，将ECO板上的31种碳源分成6类，即氨基酸类、聚合物类、双亲化合物类、胺类、羧酸类、碳水化合物类[12]。为考察储藏稻谷微生物对不同碳源类型的利用情况，按照式(1)计算每类碳源的AWCD值并分别作图。

由图2可知，随着培养时间的增加，储藏稻谷微生物对6类碳源利用的AWCD值均呈现不断增加的趋势。不同的微生物群落，其对6类碳源的利用能力不同。碳水化合物的AWCD值最高，氨基酸类和聚合物类的AWCD值相近且略低于碳水化合物，最低的是双亲化合物类，这表明储藏稻谷微生物群落对碳水化合物类碳源的代谢利用率最高，对双亲化合物类碳源的利用率最低。

图2 不同储藏年限稻谷对不同碳源的利用

对不同碳源的4种储藏稻谷样品AWCD值之间进行方差分析(表1)，结果表明：在6类碳源中，储藏稻谷微生物群落对于氨基酸类、聚合物类、双亲化合物类、羧酸类和碳水化合物类的碳源利用率没有显著差异。但是，在利用胺类碳源上，储藏稻谷的微生物群落的碳源利用率呈显著差异 (P<0.05)，利用能力大小顺序为S0>S1>S3>S2。

在储藏过程中，由于田间微生物与储藏微生物的演替以及粮库通风、熏蒸等措施，均会对储藏稻谷的微生物群落产生影响[13]。此外，稻谷储藏年限不同，其微生物群落对6类碳源中胺类碳源的利用存在显著差异，可依此作为辨别储藏稻谷微生物污染滋生程度的指标开发建立快速识别方法，这是今后需研究解决的问题。

表1 不同碳源四种储藏稻谷AWCD值的方差分析

2.3 多样性指数

微生物群落的代谢功能多样性可由功能多样性指数反映，表2显示了不同储藏年限稻谷微生物群落的Shannon多样性指数(H')、Shannon均匀度指数(E)、Simpson指数(D)、McIntosh多样性指数(U)、McIntosh均匀度指数(E)。Shannon多样性指数(H')在很大程度上受到群落物种丰富度的影响。多样性指数越高，表明储藏稻谷微生物群落的代谢功能多样性越大。Shannon均匀度指数(E)越高，微生物群落中物种数分布越均匀[14]。

由表2知，S0的微生物群落在Shannon多样性指数和Shannon均匀度指数上与其他储藏年限稻谷有显著差异(P<0.05)。S0的Shannon多样性和均匀度指数最高，其次是S1、S2和S3，表明稻谷在未储藏时，储藏稻谷中微生物的丰富性和均匀性最高，储藏环境使得微生物群落丰富性和均匀性有所下降。随着储藏时间的延长，多样性指数和均匀度均有相应地增加。然而，四种储藏稻谷的Simpson指数和McIntosh指数间没有显著的差异，表明四种储藏稻谷微生物群落中最常见的物种是相似的。

2.4 主成分分析

主成分分析被应用在多元分析中，用来评估在特定环境下微生物群落的碳源代谢情况并区分不同样品微生物群落之间的差异。通过降维，不同储藏年限稻谷间微生物群落代谢特征的差异通过在主向量空间中的点位置差异直接反映出来。如图3所示，多元向量被转换成两个不相关的主分量向量。第1、2主成分分别占总变异的62.696%和13.157%，第1主成分是变异的主要来源。由图知，稻谷样品S0,S1,S2分布点的位置与其他稻谷样品的分布点的位置存在显著的间距，而其他稻谷样品间的点位置均相近，说明未储藏新鲜稻谷的微生物群落代谢功能特性与储藏期内稻谷的微生物群落代谢功能特性存在显著差异，储藏期内稻谷间微生物群落的代谢功能特性差异不显著，说明储藏环境会对储藏稻谷微生物群落代谢功能产生一定的影响。

表2 稻谷微生物群落代谢功能多样性指数比较

注：表格中数据为平均值±标准偏差，n=4。对每类多样性指数采用Duncan多重范围检验分析，每一列不同的小写字母(a,b)表示样品间差异的显著性(P<0.05)，样品间字母相同表示之间差异不显著，不同则表示差异显著。

表3 BIOLOG ECO平板上31种碳源在第1、2主成分上的载荷值

注：未储藏新鲜稻谷3组平行样品标记为S01,S02,S03;储藏1年稻谷标记为S11,S12,S13;储藏2年稻谷标记为S21,S22,S23;储藏3年稻谷标记为S31,S32,S33。图3 不同储藏年限稻谷微生物群落功能特性主成分分析得分图

从6类碳源中31种碳源在2个主成分上的载荷值在表4中可见，除吐温40，α-环式糊精，D-木糖，D-半乳糖醛酸，D-葡萄糖氨酸，衣康酸和L-苏氨酸外，其余24种碳源均集中在第1主成分上，决定了主成分1的变异，主要包括双亲化合物类、氨基酸类、羧酸类、碳水化合物类和胺类。影响主成分2变异的碳源主要包括1-磷酸葡萄糖，D,L-α-磷酸甘油，4-羟基苯甲酸，衣康酸，苯乙胺和腐胺，主要属于双亲化合物类和胺类。综合第1、2主成分结果，被稻谷微生物群落特异利用的碳源有：D-木糖，衣康酸与主成分1呈显著负相关，而与主成分2呈显著正相关；丙酮酸甲酯，N-乙酰-D-葡萄糖胺，2-羟基苯甲酸与主成分1呈显著正相关，而与主成分2呈显著负相关。

3 结论

稻谷在未储藏期，其微生物群落代谢功能最旺盛，在储藏1年后微生物群落代谢功能达到最低，其后随着储藏时间的增加，微生物群落代谢功能逐渐增加。

在6类碳源利用中，4种稻谷样品的微生物群落对碳水化合物类碳源的代谢利用能力最强，且其对胺类碳源的代谢利用间存在显著差异(P<0.05)。

未储藏新鲜稻谷的微生物群落多样性最大，进入储藏期后，随着储藏时间的增加，微生物群落多样性呈现先增加后减少的趋势。

通过主成分分析发现，未储藏新鲜稻谷微生物群落的代谢功能与其他储藏年限稻谷微生物群落的代谢功能存在显著的差异。