人参BBM基因全长cDNA的克隆及生物信息学分析

李 昂， 姬文秀， 陈双越, 包悦琳, 陈 鸽， 金东淳

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

植物体细胞在离体培养条件下，通过与合子胚发育相似的途径形成胚结构，并进一步发育成完整植株。植物体细胞胚具有较高遗传稳定性，而且能够高效获得再生植株，因此,诱导植物体细胞胚在研究植物形态建成、作物品种改良、突变体筛选以及植物遗传转化等诸多方面具有重要意义。

Steward[1]和Reinert[2]分别在胡萝卜韧皮部细胞悬浮培养过程中最早观察到植物体细胞胚胎发生这一现象。研究发现细胞组织培养过程中体细胞胚胎发生与植物合子胚发育有着相似的过程，都经过球形胚、心形胚、鱼雷形胚以及子叶形胚等阶段。研究发现诱导植物体细胞胚发生过程受制于培养基的组成、植物生长调节剂的种类和浓度、外殖体(不同的组织或器官)以及外植体的遗传背景等很多因素，不同植物诱导体细胞胚难易度存在较大差异[3]，导致很多植物中至今无法利用体细胞胚发生这一植物所特有的潜力。

随着分子生物学技术的发展和植物体细胞胚胎发生机理研究的深入，一些与植物体细胞胚胎发生有密切关联的基因，如，WUSCHEL(WUS)[4-5]、SERK[6-7]，LEAFYCOTYLEDON(LEC)[8-9],AGAMOUS-LIKE15 (AGL15)[10]和BABYBOOM(BBM)[11-12]等已被发现。已有研究表明,BABYBOOM(BBM) 基因在植物体细胞胚胎发生过程中起到关键作用[13]。在拟南芥、油菜[11]、大豆[14]和烟草[15]中，不添加任何植物生长调节剂的条件下，BBM基因的过量表达能够诱导胚性愈伤组织和体细胞胚的形成。

为利用BBM基因诱导人参体细胞胚进而建立高效的人参再生植株生产体系，本研究通过RACE方法成功地克隆了人参BBM基因(PgBBM)并进行了相关的生物信息学分析, 这为利用BBM基因诱导人参体细胞胚等相关研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1) 材料 从人参叶片中诱导出来的生长旺盛的愈伤组织迅速置于液氮中速冻，然后放入超低温冰箱储存备用作为提取RNA的试验材料。

2) 试剂 实验所用主要试剂：Eastep®super RNA extraction kit (promega)、GoscriptTMReverse transcription system(promega)、SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech)、pGEM®-T Easy Vetor systems (promega)等购自上海生工生物工程；Tinquick Midi purification kit、感受态 DH5α、预混 Taq、X-gal、IPTG、Marker (DL2 000 )等购自天根(Tiangen)。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

采用Primer 5和Oligo 6.0设计基因克隆所用引物。具体引物序列如表1。

表1 PgBBM 扩增引物

1.2 试验方法

1.2.1 总 RNA 提取及 cDNA 合成

取1 g、-70 ℃超低温冰箱保存的人参愈伤组织，用液氮研磨后，利用 RNA 提取试剂盒(Eastep®super RNA extraction kit,prom ega)提取总 RNA。取1 μg总 RNA，用反转录试剂盒(GoscriptTMReverse transcription system,promega)合成 cDNA。

1.2.2 人参BBM基因部分片段的PCR扩增

根据NCBI已登录的其它拟南芥(AtBBM,NM_121749.2)等植物BBM基因序列的保守区设计简并引物BBM-F和BBM-R(表1)。PCR 扩增反应总体系为25 μL：cDNA模板1 μL，dNTP(10 mmol/L) 0.5 μL，BBM-F，BBM-R(10 mmol/L)各0.5μL，Taq酶0.2 μL，缓冲液2.5 μL，双蒸水19.8 μL。扩增程序：94 ℃，5 min；94 ℃，1 min；55 ℃，45 s；72 ℃，1 min，36个循环；72 ℃，10 min。取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 部分片段回收、测序

将PCR扩增的人参BBM基因片段产物用 Tinquick Midi purification kit(天根)纯化试剂盒回收，与载体(pGEM®-T Easy Vetor systems,promega)连接，转化大肠杆菌感受态 DH5α，涂在含有 100 μg/mL Amp的LB固体培养基上，37 ℃倒置培养过夜，挑取单菌落，在含Amp的液体LB培养基上37 ℃ 摇菌4 h，经菌液PCR检测，将阳性克隆送上海生工公司测序。

1.2.4 人参BBM基因5’和3’RACE扩增

根据获得的人参BBM基因的部分片段，分别设计5’端和3’端特异性巢式 PCR 引物(表1)，以人参愈伤组织 cDNA 为模板，经2轮巢式 PCR 扩增，分别扩增BBM基因的5’端和3’端序列，具体步骤按照 Clontech 公司 SMARTerTMRACE 扩增试剂盒说明进行，将目的片段进行回收、连接、转化和鉴定后，阳性克隆送到上海生工进行测序。

1.2.5 人参BBM基因cDNA全长的获得和生物信息学分析

分别将人参BBM基因的5’ RACE和 3’RACE的测序结果，用DNAman软件进行拼接获得人参BBM基因的全长cDNA。利用ORF Finder在线工具对获得的cDNA序列进行开放阅读框(ORF)查找分析；根据人参BBM基因的ORF序列设计引物(QB542F1，QB542R1，表1)扩增全长ORF序列。用NCBI的Conserved Domain Database(CDD)在线工具进行功能结构域分析，利用MEGA 5.0软件构建进化树和功能域比对分析。

3 结果与分析

3.1 总RNA的提取及检测

提取的人参总RNA，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1-A，由图可见28S rRNA和18S rRNA条带明亮清晰，说明所提取的RNA完整性较好。经微量分光光度计测得OD260/OD280为2.05，OD260/OD230为1.84，表明RNA纯度较高，可以用于RT-PCR扩增试验。

3.2 人参 BBM 基因部分片段的扩增及全长 cDNA 的获得

以人参总RNA反转录所得到的cDNA为模板，进行PCR扩增后，扩增产物经凝胶电泳检测发现约400 bp左右的条带(图1-B)，与预期片断的大小一致，目的基因片段经过纯化、连接、转化后，阳性克隆经测序得到428 bp 的目的基因片段。

A-提取的RNA电泳图谱；B-PCR扩增的BBM基因片段电泳图谱；C,D-BBM基因3′ RACE和5′ RACE扩增结果；E-BBM基因全长ORF扩增结果

图1 人参BBM基因克隆过程中的主要电泳图谱
Fig.1 The several main electrophoretic pattern in the cloning of ginsengBBMgene

根据获得的人参BBM基因片段的序列，分别设计5’端和3’端特异性巢式 PCR 引物，以cDNA为模板，经2轮巢式PCR扩增3’端和5’端基因序列并测序，得到3’端基因序列长度为1 356 bp的片段和5’端基因序列长度为1 164 bp的片段(图1-C,D)，得到2 291 bp的全长cDNA。将本试验获得的人参BBM基因命名为PgBBM。根据人参BBM 基因的ORF序列设计引物(QB542F1，QB542R1，表1)扩增全长ORF序列结果如图1-E。

3.3 人参BBM同源基因的生物信息学分析

在NCBI的ORF finder软件上查找人参BBM基因的编码区，发现该基因的ORF为1 998 bp，该基因所编码的蛋白含有665个氨基酸。用其推测的编码蛋白序列与拟南芥等植物的BBM基因序列比对结果，人参BBM基因中包含euANT1-euANT6、bbm-1等基序，还包含由Linker连起来的2个AP2结构域(AP2-R1和 AP2-R2)(图2)，说明PgBBM是属于AP2亚族的转录因子。人参BBM基因中各基序及功能结构域的具体排列顺序为euANT2-euANT3-bbm-1-euANT5-euANT4-AP2-R1-Linker-AP2-R2-euANT6(图2)。由人参BBM基因推测的编码蛋白序列与其它植物已知BBM基因构建的系统发育树显示，人参BBM基因与烟草聚为一类，说明人参BBM基因与烟草亲缘性最近。也表明与大豆、苜蓿的BBM基因亲缘关系较近，与其它植物的BBM基因的亲缘关系较远(图3)。

比较的植物及登录号分别为：ArabidopsisthalianaAtBBM (NM_121749.2)，BrassicanapusBnBBM1 (AF317904.1)，NicotianatabacumNtBBM (XP_016452614.1)，GlycinemaxGmBBM1 (HM775856)，MedicagotruncatulaMtBBM (AY899909)，RosacaninaRcBBM1 (KC429673)和RcBBM2 (KC429674)。黑色表示的是保守序列。

图2 推测的人参BBM蛋白氨基酸序列与其它BBM蛋白的比较结果

Fig.2 The comparison of the deduced amino acid sequences ofP.ginsengBBMgene (PgBBM), and other BBM proteins

比较的植物及登录号分别为：NicotianatabacumNtBBM(XP_016452614.1)，GlycinemaxGmBBM1 (HM775856)，MedicagotruncatulaMtBBM (AY899909)，RosacaninaRcBBM1 (KC429673)和RcBBM2 (KC429674)，ArabidopsisthalianaAtBBM (NM_121749.2)，BrassicanapusBnBBM1 (AF317904.1)和BnBBM2 (AF317905.1)，ZeamaysZmBBM1 (NM_001154063)，CenchrusciliarisCcASGRBBM (EU559278)，PennisetumsquamulatumPsASGR-BBM-like1 (EU559280) 和 PsASGR-BBM-like2 (EU559277)，ArabidopsisthalianaAtANT (U41339.1)。

图3 基于BBM基因同源性的系统进化树

Fig.3 The phylogenetic tree analysis ofP.ginsengBBMgene (PgBBM), and other BBM proteins

4 讨论与结论

转录因子(transcription factor，TF)是一类 DNA 结合蛋白，通常这些转录因子会参与到植物的信号转导通路中，在相关信号的刺激下能够与靶基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性相互作用，特异激活或抑制相关基因表达。近年来，从植物中分离出大量的转录因子，根据它们的DNA结合域的特点可以把其分成若干个家族。其中AP2/EREBP家族转录因子与植物的生长发育和胁迫应答密切相关，是植物中一类非常重要的转录因子。其中AP2(APETALA2)亚族转录因子主要与植物发育调控有关，如决定花器官的形态和发育、控制花序分生组织的形成、侧根形成及胚珠和种子的正常发育等[16]。BBM基因属于AP2(APETALA2) 亚族的转录因子。BBM(BABYBOOM)在体细胞胚发育过程中特异性表达。BBM的过量表达可诱导体细胞胚胎的发生或促进胚胎发育[11]。在大豆[14]，拟南芥和油菜[11]中，在不添加任何植物生长调节剂的条件下，BBM的过量表达能够诱导胚性愈伤组织和体细胞胚的形成。已有的研究结果表明BBM基因是诱导植物体细胞胚的关键基因。本研究中通过 RACE 方法成功地克隆了人参BBM基因(PgBBM), 这为利用BBM基因诱导人参体细胞胚以及进行相关研究奠定了基础。

至今为止，已在许多植物中克隆并鉴定了BBM基因，通过预测的氨基酸序列构建系统发育树比较分析不同植物BBM基因的同源性，也有对不同植物BBM基因的功能区域的比对分析，如，Bremer 等[17]通过系统发育分析发现，RcBBM1、RcBBM2与GmBBM1、MtBBM的关系更为密切；Ouakfaoui等[18]在AtBBM、BnBBM和GmBBM1氨基酸序列中鉴定出相同的结构域。本研究中，基于人参BBM基因的全长cDNA预测的编码蛋白的氨基酸序列构建结果，发现人参BBM基因与烟草的BBM基因亲缘性最近，与大豆、苜蓿的亲缘性较近，与其它植物中BBM基因的亲缘性较远。与其它植物已知的BBM基因的氨基酸序列比对结果，发现本研究中克隆的人参BBM基因同样具有其功能所需的基序和结构域，说明本研究中克隆的基因是BBM基因(PgBBM)。从BBM基因的氨基酸序列比对结果中发现，人参BBM基因的不同基序以及结构域中存在多个与其它植物不同的氨基酸残基(residues)，如在AP2-R1结构域中，拟南芥和油菜中是赖氨酸(K)，而人参中为精氨酸(R)。这种基序或功能域中的个别氨基酸残基差异是否影响其正常功能，有待于进一步研究。