菊花“红粉”ד延红”杂交种组培快繁技术

岳圆圆， 陈 慧， 全英杰， 龚 晨， 李 鑫， 高 日*

(1.延边大学农学院，吉林 延吉 133002；2.吉林广播电视大学,吉林 长春 130000)

菊花(Chrysanthemummorifolium(Ramat.) Tzvel.)属于菊科菊属多年生宿根草本花卉。原产于我国，是我国传统的名花，也是世界4大切花之一，深受各国人民的喜爱[1]。菊花品种繁多，花色丰富，姿态各异，鲜切小菊可以用来插制花篮、花束等，园林布景也可以用地被菊设计花坛和花台等，具有很高的观赏价值[2]。菊花大部分品种具有耐寒性，但也有部分品种耐寒性较弱[3]，生产中通常采用传统杂交技术培育耐寒新品种，杂交后收获得种子数量较少，土壤播种繁殖成活率较低，严重影响杂种后代的选育[4]。然而，采用组织培养技术培养菊花成活率较高，而且繁殖系数大。李晓亮等[5]以地被菊花“香草水晶”茎尖为材料，研究瓶内快繁技术发现，试管苗增殖最佳培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.01 mg/L+白砂糖20 g/L，增殖系数为17.95；施敏等[6]以地被菊花“千代姬”的叶片为外植体，发现适合丛生芽增殖培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，试管苗在培养基1/2 MS+0.1 mg/L NAA中生根较多，由此可见，菊花不同品种组织培养所用的培养基成份有差异。本试验以“红粉” × “延红”杂交种子为材料，研究外植体消毒时间、生长调节剂浓度以及基本培养基浓度对其增殖和生根的影响，旨在建立再生体系，为菊花的杂交品种选育和快繁提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以抗寒品种“延红”(父本)和莲座花型“红粉”(母本)进行杂交，霜后收获的种子为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 外植体消毒

用洗衣粉清洗杂交种子后置于烧杯中，流水冲洗1～2 h，在超净工作台内，用70%酒精表面消毒30～40 s后，生汞(HgCl2)溶液浸泡消毒。每个处理10个杂交种子，浸泡时间分别为5、8、11和14 min，无菌水冲洗后接种到MS+蔗糖30 g/L+琼脂粉7.0 g/L(pH值5.8)培养基中，培养温度(25±2) ℃，相对湿度70%，光照强度1 600 lx，每天光照16 h。15 d后调查发芽率。

1.2.2 BA和NAA对试管苗增殖生长的影响

将无菌苗切成1 cm长的茎段，接种于MS附加

不同浓度BA和NAA的培养基中，BA浓度设为0.5，1.0，1.5和2.0 mg/L，NAA浓度设为0.1，0.2，0.3和0.4 mg/L，分别进行组合，共16个组合，蔗糖30 g/L，琼脂粉7.0 g/L，pH值5.8，每个处理重复3次。光照强度1 600 lx，培养温度(25±2) ℃，相对湿度70%，培养30 d后，调查株高，节数，地上部干物重和不定芽数。

1.2.3 IBA浓度对试管苗生根的影响

将1 cm左右长的茎段接种在含有不同浓度IBA的MS培养基中，蔗糖30 g/L，琼脂粉7.0 g/L，IBA浓度设为0.25，1.0，1.5，2.0 mg/L。每个处理重复3次，培养条件同1.2.1，30 d后，调查株高，地上部干重，根长，根数和地下部干重。

1.2.4 MS培养基浓度对生根的影响

将试管苗分别接种于不同浓度的MS(1/4 MS，2/4 MS，3/4 MS和4/4 MS)培养基中，培养基其他成分为IBA 1.0 mg/L，蔗糖30 g/L，琼脂7.0 mg/L，MS基本培养基设为培养条件同1.2.1，30 d后观察并统计株高，地上部干重，根长，根数和地下部干重。

1.2.5 炼苗与移栽

清洗幼苗根系中的培养基，放入培养瓶中并加入水，覆盖塑料薄膜保湿炼苗，7 d后，移栽到腐殖土和珍珠岩(3∶1)混合的基质中，30 d后调查成活率。

1.3 数据分析

试验数据用SPSS 11.0软件进行统计分析，采用邓肯氏新复极差法作显著性差异分析，显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 外植体消毒时间对种子发芽的影响

试验利用升汞对种子进行消毒，发现消毒时间对种子发芽率影响很大。由图1可知，消毒时间从5 min增加至8 min时，种子发芽率逐渐增加，最高达到78.3%，但消毒时间继续增加时，种子因种皮受到破坏，消毒液进入种子内使种子发芽率降低，在消毒14 min时，种子发芽率只达到7.5%。因此，为获得无菌苗，“红粉” × “延红”杂交种子消毒时间以8 min为宜。

图1 消毒时间对“红粉” × “延红”杂交种子发芽率的影响

2.2 BA和NAA浓度对试管苗增殖生长的影响

将1 cm高的无菌苗接种在含BA和NAA不同浓度组合的培养基中，30 d后调查试管苗增殖生长情况。BA和NAA不同浓度配比组间，节数有很大差异(表1)。

表1 BA和NAA浓度对试管苗增殖生长的影响

注：表中数据为0.05显著水平的多重比较结果。

由表1可知，组合BA 0.5 mg/L+NAA 0.4 mg/L的试管苗节数最多(7.7)，显著高于其他组合，为对照的1.5倍。各组合中，试管苗不定芽数无显著差异。对试管苗株高和干重进行调查发现，同样在BA 1.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L组合中，试管苗生长最佳，株高为5.9 cm，干重为506.7 mg，都显著优于对照(CK)和其他处理。因试管苗节数、株高及干重在BA 1.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L组合中最佳，可选择此培养基作为“红粉” × “延红”杂交种试管苗进行增殖培养。

2.3 IBA浓度对试管苗生根的影响

在试管苗生根培养过程中，为了促进试管苗根和茎叶的生长，本试验在MS培养基中加入不同浓度的IBA进行生根培养。结果表明，在所用培养基中试管苗均可生根。培养基中加入适宜浓度的IBA可促进试管苗地上部和地下部的生长，在IBA 1.0 mg/L时，根长、根数、根干重、株高和茎叶干重均达到最高值，高于此浓度时，根及茎叶生长反而低于对照。在IBA为1.0 mg/mL处理中，株高、茎叶干重、根长、根数和根干重分别达到3.6 cm，394.8 mg，2.7 cm，13.8个和24.3 mg(表2)，尤其是根长和根数，为对照的1.9和1.8倍。因此，在进行试管苗生根培养时，培养基中加入IBA1.0 mg/L较为适宜。

表2 IBA浓度对试管苗生根影响

2.4 MS基本培养基浓度对试管苗生根的影响

由表3可知，MS基本培养基浓度对试管苗根和茎叶的生长影响很大。当MS基本培养基浓度降至3/4时，利于试管苗根生长，但MS浓度继续下降时，试管苗生长受到抑制。在3/4MS时，试管苗根长、根数和根干重显著高于MS培养基，但株高和茎叶干重与MS培养基无显著性差异。因此，试管苗生根培养时可将MS培养基浓度降低至3/4。

表3 MS培养基浓度对试管苗根和茎叶生长的影响

2.5 驯化移栽

增殖培养的试管苗(图2a)经生根后，选择健壮的生根苗(图2b)进行驯化移栽。用清水冲洗试管苗根部的琼脂后，将其放入装有水的培养瓶中，用塑料薄膜覆盖保湿，1周后，移栽到经灭菌的栽培基质中(腐殖土∶珍珠岩=3∶1)。移栽30 d后调查幼苗成活情况，其成活率高达95%以上(图2c)。

图2 “红粉” × “延红”杂交种的增殖(a)和生根试管苗(b)和移栽苗(c)

3 讨论与结论

植物生长调节剂对植物形态发育具有重要作用，细胞分裂素和细胞生长素合理的比例会促进细胞的分裂，诱导植株的增殖[7]。植物组织培养过程中，常用的细胞分裂素为BA，ZT和KT等，生长素为NAA和IBA等。目前，关于菊花组培方面的研究较多，但结果不尽相同，小黄菊不定芽诱导的最佳培养基为MS+BA 2 mg/L+NAA 1.0 mg/L[8]，而菊花脑为MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L[9]。本研究发现，MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L最利于“红粉” × “延红”杂交种试管苗增殖培养(表1)。这些研究表明，即便都是菊科植物，不同种或品种的组培所需培养基不同。因此，针对特定种或品种筛选适宜的培养基是提高培养效率的重要手段。另外，本研究发现BA和NAA对“红粉” × “延红”杂交种不定芽增殖无促进作用，但可显著增加株高和节数，因此，对于此杂交种进行增殖培养时可以茎段作为主要的外植体。生根研究发现，3/4 MS培养基中，根生长显著好于MS培养基(表3)，但在2/4 MS或1/4 MS培养基中，试管苗地上和地下部生长较弱，可能是培养基中无机盐浓度减少引起[10]。