25份烟草品种(系)低温诱导早花耐易性鉴定及分类

王欣亚， 吴委林， 南桂仙， 杜鑫宇， 任雅萍， 朴世领

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

烟草是一种以收获叶片为主的经济作物，其叶数与经济产量和经济效益密切相关[1]。苗期低温会促进花芽分化，提早开花，导致叶片较少。烟草早花，指在生长过程中受到单个或多个因素的影响，以及未达到正常株高及有效叶数而提前开花的现象[2]，内在因素指烟草品种的遗传特性[3]，进而决定其生育特性及对环境的敏感性[4],外在因素包含的常见因素有，光周期、干旱及低温胁迫等[5]。低温是导致烟草早花的主要原因之一，发生早花现象的烟株表现为植株矮小，生长势弱，叶数锐减，并提前现蕾开花[6-8]。我国烟区面积广，气温变幅较大，早春低温引起烟草早花是生长过程中面临的重要问题，由于气候条件不同，早花期的程度因年而异，严重情况下，导致单株叶数减少6～7片以上，烟叶质量不佳且减产10～20%[9]。挖掘耐早花基因，培育耐早花品种是最经济有效的解决措施。本试验，利用人工气候箱控制温度，通过体视显微镜法观察低温对花芽分化进程的影响，旨在筛选耐低温早花品种，基于相对早花指数(RE)和相对叶数减少指数(RL)通过聚类分析法对不同烟草品种对早花的耐易程度进行分类，为今后地方烟草品种低温早花相关候选基因的定位与遗传效应分析提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

以25份烟草品种(系)为试材，其中包括18份烤烟品种(1～18)，7份晒烟品种(19～25)。

试验地为土壤质地肥沃且灌溉条件优良的延吉市小营镇河龙村，土层深厚，土地肥力适中，且地势平坦，适宜烟草种植。2018年5月于延边大学农学院通过人工气候培养箱对25份烟草品种进行低温处理，参试品种详情见表1。

表1 试验品种(系)及编号

1.2 试验设计

将25份烟草品种在3片真叶时假植于简塑盘中，每个品种4盘(100株/盘)，温室培养。待烟苗长至5～6叶龄时，采用人工气候箱，通过温度控制对其进行低温处理，每个处理选取150株长势及形态基本一致的烟苗，将其转入人工气候箱(HPG-280H)，低温胁迫设置温度为(11±0.5) ℃，光暗时长各12 h，处理时间为11 d。以室温(24±2) ℃条件下培养作为对照。5月23日将低温处理(T)品种及未处理(CK)的对照统一移栽至大田。于移栽后21 d开始取茎尖观察花芽分化进程，并于移栽后35 d开始调查有效叶数、现蕾数及现蕾率，依据调查结果计算相对早花指数(RE)和相对叶数减少指数(RL)，并对其进行早花耐易性分类及鉴定。

1.3 测定项目及测定方法

1.3.1 调查方法

利用体视显微镜观察低温诱导对花芽分化进程的影响，移栽后35 d开始调查大田烟株有效叶片数、现蕾数及现蕾率。以观察及调查结果为依据分别计算相对早花指数(RE)及相对叶数减少指数(RL)，并根据如下公式进行计算。

1.3.2 体视显微镜观察法

移栽后21 d早晨开始对烟株的茎尖取样，使用医用手术刀片切取自茎尖向下约5 cm处，用锡纸包好后放入装有冰块的冰盒取回，每2 d取1次，带回实验室后对茎尖进行切取，长度2.0 cm左右，将其置于普通医用注射器(20 mL)中，用于抽取茎尖组织内空气，抽取完毕后，放入FAA固定液的试剂瓶内固定保存。固定48 h后，采用体视显微镜(Olympus SZX7)观察并对固定后的茎尖进行解剖，调整好后拍照纪录[10]。由于多个试验项目同时进行，且体视显微镜观察花芽分化进程的镜检次数多、耗时久，本试验以观察效果最佳的延晒9号和NC82这2个品种观察图为例进行花芽分化过程的详细说明。

1.4 数据统计和分析

试验以25份烟草品种的相对早花指数及相对叶数减少指数为基础，将数据标准化处理后，运用Statistica 10.0软件，基于欧氏距离(Euclidean distance)，采用离差平方和法(Word’s method)进行聚类分析[11]。采用软件SPSS 20.0进行数据统计和分析，用Duncan法对试验数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 结果与分析

2.1 不同烟草品种(系)苗期低温诱导对花芽分化进程的影响

2.1.1 花芽分化进程的划分

据前人多次烟草镜检及研究表明，不同烟草品种花芽分化过程的形态学变化大致相似[12]。烟草花芽分化大体可分6个时期(图1)，分别是：营养生长期(A)、营养生长向生殖生长转化期(B)、花原基分化期(C)、花萼原基分化期(D)、花瓣、雄蕊原基形成期(E)、雌蕊原基形成期(F)。

2.1.2 低温处理对不同烟草品种(系)花芽分化进程的影响

2.1.2.1 低温处理对晒烟花芽分化进程的影响

7份晒烟品种的花芽分化进程(表2)中，低温处理组均较未处理组提早完成花芽分化。以延晒9号为例(图2，3)，苗期未进行低温诱导处理的花芽分化是在移栽后21 d开始，在移栽后42 d花芽分化基本完成；进行低温诱导处理的花芽分化开始也是在移栽后21 d，而花芽分化基本完成是在移栽后41 d。由此可见，苗期进行低温处理的延晒9号花芽分化进程比未进行低温处理的提前约1 d。

A：雄蕊原基；C：花瓣原基；G：雌蕊原基；L：叶原基残留部分及叶原基；K：花萼原基；M：生长点

品种(系)处理移栽后21 d移栽后25 d移栽后29 d移栽后33 d移栽后37 d移栽后41 d小码稀TAB+C+D+E+FCKABCDE-F-8107TABC+D+EF+CKABCDEF-千层塔TAA+B+D-E+F+CKAABC+D+F护脖香TAB+C+D+E+F+CKABCDEF延晒9号TAB-CD-EF-CKAB-C-D-E-E+自来红TAB+CD+E+F+CKABC-DEF建平大兰花TAC-DEFF+CKAB+C+DEF

注：T表示处理，CK为对照；其中，A～F代表烟草花芽分化的6个阶段；-代表未超过；+代表超过；下同。

图2 苗期进行低温诱导的延晒9号花芽分化进程

图3 苗期未进行低温诱导的延晒9号花芽分化进程

2.1.2.2 低温处理对烤烟花芽分化进程的影响

低温处理对18份烤烟品种花芽分化进程的影响(表3)表明，低温处理组(T)的花芽分化进程均较对照组(CK)提前。以NC82号为例(图4，5)，进行低温处理的花芽分化开始是在移栽后30 d，花芽分化基本结束在移栽后51 d；而未进行低温处理的在移栽后34 d花芽开始分化，移栽后55 d花芽分化基本结束。NC82的低温处理与未处理相比，花芽分化进程整体提前4 d左右。

表3 低温处理对不同烤烟品种花芽分化的影响

图4 苗期进行低温诱导的NC82花芽分化进程

图5 苗期未进行低温诱导的NC82花芽分化进程

2.2 25份烟草品种(系)聚类分析结果

相对早花指数(A)及相对叶数减少指数(B)的聚类分析列于图6，结果显示，无论是基于相对早花指数还是相对叶数减少指数的聚类分析，均将25份烟草品种划分为2大类群，耐早花品种类群(I)和易早花品种类群(II)2大类。其中，耐早花品种类群(I)包含2个亚类群(I-1、I-2)：I-1(耐早花品种亚类群)包含4个品种，分别为龙江981、K326、延晒9号、CV91。I-2(较耐早花品种亚类群)在A和B 2个聚类中略有差异，基于A的聚类分析中I-2(较耐早花品种亚类群)包含9份品种，分别为吉烟9号、延吉千层塔、自来红、8107、CF222、9407、白城护脖香、CF205、CF209；基于B的聚类分析中I-2(较耐早花品种亚类群)包含8个品种，分别为吉烟9号、9407、CF222、CF209、8107、筑波一号、白城护脖香、小黄烟。易早花品种类群(II)也包含2个亚类群(II-1、II-2)，II-1(较易早花品种亚类群)在A和B 2个聚类中也略有差异，基于A聚类中，II-1(较易早花品种亚类群)包含的9个品种为筑波一号、温德尔、小黄烟、云烟119、韩国一号、小码稀、云烟87、安南、宣洞区；基于B聚类中，II-1(较易早花品种亚类群)包含的10个品种为CF205、延吉千层塔、自来红、温德尔、安南、云烟87、韩国一号、小码稀、云烟119、宣洞区；II-2(极易早花品种亚类群)共包含3个品种为，NC82、建平大兰花、NC89。

图6 基于相对早花指数(A)及相对叶数减少指数(B)的聚类类群

2.3 25份烟草品种(系)低温诱导早花耐易性鉴定结果

25份参试品种相对早花指数调查结果列于表4，人工鉴定结果共分为4个等级：1) 耐低温早花品种—简称耐早花(R)，其相对早花指数范围分布在1.0%～6.0%，共有4份烟草品种，分别为龙江981、CV91、K326及延晒9号；2) 较耐低温早花品种—简称较耐早花(MR)，相对早花指数分布范围在6.0%～10.0%，共计9份烟草品种，分别是吉烟9号、延吉千层塔、自来红、8107、CF222、9407、白城护脖香、CF205、CF209；3) 较易低温早花品种—简称较易早花(ME)，相对早花指数分布范围在10.0%～16.0%，共9份品种，分别为筑波一号、温德尔、小黄烟、云烟119、韩国一号、小码稀、云烟87、安南、宣洞区；4) 极易低温早花品种—简称易早花(E)，相对早花指数在16.0%以上，共计3份烟草品种，分别是NC89、建平大兰花及NC82。说明不同烟草品种间的相对早花指数存在差异及低温诱导对各品种烟草早花程度存在不同差异性。

表4 25份烟草品种(系)相对早花指数调查及鉴定结果

不同参试品种相对叶数减少指数的调查结果(表5)表明，K326、龙江981、延晒9号、CV91，4份烟草品种的相对叶数减少指数均<7.5%，为耐早花品种。吉烟9号、9407、CF222、CF209、8107、筑波一号、白城护脖香、小黄烟，8份烟草品种的相对叶数减少指数均在7.5%～15.0%，为较耐早花品种。CF205、延吉千层塔、自来红、温德尔、安南、云烟87、韩国一号、小码稀、云烟119、宣洞区，10份烟草品种的相对叶数减少指数均在15.0%～27.0%，为较易早花品种。NC89、建平大兰花及NC82，这3份品种的相对叶数减少指数均>27.0%，为极易早花品种。

表5 25份烟草品种(系)相对叶数减少指数调查及鉴定结果Table 5 Investigation and identification of relative leaf number reduction index of 25 tobacco varieties(lines)

2.4 25份烟草品种(系)的耐易性

25份参试品种差异显著性分析结果列于表6，2大类群间的相对早花指数(A)和相对叶数减少指数(B)均存在极显著差异(P<0.01)，每个亚类群之间(I-1、I-2、II-1、II-2)相对早花指数(A)和相对叶数减少指数(B)也都存在显著性差异(P<0.05)。由此可见，无论是基于A指数还是B指数上，通过系统聚类均能将25份烟草品种对低温诱导早花的耐易性进行有效的分类。

在I和II 2个大类群中，I类群的相对早花指数(均值7.52%±0.25%，变幅4.11%～9.69%)和相对叶数减少指数(均值10.58%±1.45%，变幅3.98%～14.49%)与II类群的相对早花指数(均值15.68%±0.26%，变幅14.2%～17.7%)和相对叶数减少指数(均值25.53%±1.61%，变幅17.24%～32.41%)存在极显著差异(P<0.01)。A指数与B指数的不同亚类群之间(I-1、I-2、II-1、II-2)也均存在显著性差异(P<0.05)。说明基于相对早花指数(A)和相对叶数减少指数(B)的聚类法划分25个烟草品种的早花耐易性结果基本一致。

表6 基于相对早花指数(A)及相对叶数减少指数(B)类群对低温诱导早花的耐易性

注：不同小写字母代表在处理间显著差异水平(P<0.05)，不同大写字母代表在处理间差异极显著水平(P<0.01)。

3 讨论与结论

3.1 25份烟草品种(系)苗期低温诱导早花聚类分析

聚类分析是对数理性质上相似的对象进行归类划分[13-15]，将不同集合的抽象对象按其性质划分为多个组别的过程[16-17]。通过物以类聚的原理将数据分为不同的类群及亚类群，将不同相似性的对象归纳进一个组内更加直观明了便于观察，采用聚类分析对低温诱导早花耐易性划分结果更为可靠。本试验，首次采用相对早花指数(RE)和相对叶数减少指数(RL)衡量不同品种(系)烟草低温诱导早花的耐易性及分类，无论是基于RE还是RL进行聚类都将25份烟草品种分为耐早花品种和易早花品种2大类群，其中耐早花品种类群(I)包括2个亚类群：I-1(耐早花品种亚类群)、I-2(较耐早花品种亚类群)；易早花品种类群(II)也包含2个亚类群(II-1、II-2)，II-1(较易早花品种亚类群)、II-2(极易早花品种亚类群)；以RE和RL 2个指标分别进行聚类分析结果显示：II-1、I-2亚群间略有差异，但各类群品种划分大体相同。耐早花与易早花2大类群间都存在极显著差异，且4个亚类群间均有显著差异。

3.2 25份烟草品种(系)苗期低温诱导早花耐易性鉴定

烟草是以收获叶片为主的经济作物，受早花影响的烟株较正常生长的烟株矮小，叶数锐减，且叶片窄而小，提前达到现蕾期，这极大影响了烟草的产量进而造成经济损失[1]。本试验移栽后不同品种低温处理组较对照均相对矮小，且通过体视显微镜观察，低温处理花芽分化进程较对照均提前，低温处理时间越长，进入花芽分化阶段越早，早花现象越明显，这与前人[18-20]对低温诱导早花研究结果相吻合。

通过调查不同烟草品种移栽后低温处理组和对照组达到现蕾期天数及田间有效叶数的调查，并结合各品种处理及对照进入花芽分化各个阶段的时间计算出RE和RL来判断对早花的耐易性，结果表明：龙江981、CV91、K326及延晒9号，4份烟草品种低温处理与对照相比现蕾期提前1 d左右，相对早花指数为1.0%～6.0%，为耐早花品种；吉烟9号、延吉千层塔、自来红、8107、CF222、9407、白城护脖香、CF205、CF209，9份烟草品种低温处理较对照现蕾期提前2～3 d，相对早花指数均在6.0%～10.0%，为较耐早花品种；筑波一号、温德尔、小黄烟、云烟119、韩国一号、小码稀、云烟87、安南、宣洞区，9份品种低温处理较对照现蕾期提前3～4 d，相对早花指数在10.0%～16.0%，为较易早花品种；NC89、建平大兰花及NC82，3份品种低温处理较对照现蕾期均提前4 d以上，相对早花指数为16.0%以上，为极易早花品种。由此可见，基于相对早花指数(RE)和相对叶数减少指数(RL)对25份烟草品种苗期低温诱导早花聚类分析的耐易性鉴定结果可靠，为今后优良品种的选育和耐低温早花基因的挖掘奠定基础。