小麦 TaCP3基因的克隆及其参与非生物胁迫的表达分析

张炳慧，高 翔,2，杨明明，王宪国，何庆梦，姚晓露，李晓燕，赵万春,2，董 剑,2

(1.西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100； 2.陕西省小麦工程技术研究中心/陕西省小麦新品种培育工程研究中心，陕西杨凌 712100)

半胱氨酸蛋白酶(CP)是植物中重要的蛋白酶家族之一，广泛参与植物的各种生理过程，比如贮存蛋白的沉积和降解、对非生物胁迫和生物胁迫的响应、植物的衰老和细胞程序性死亡(PCD)等[1]。Rawlings等[2]把半胱氨酸蛋白酶大致分为15个家族，分属于5大类。包括C1：Papain，木瓜蛋白酶；C2：Calpain,钙依赖半胱氨酸蛋白酶；C12：催化蛋白去泛素化的半胱氨酸蛋白酶；C13：Legumain，豆类天冬氨酸蛋白内切酶；C14：天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶；C19：蛋白酶体。大多数植物半胱氨酸蛋白酶属于Papain(木瓜蛋白酶)(C1)和Legumain(豆类天冬氨酸蛋白内切酶)(C13)家族。Papain-like蛋白家族(C1A)是植物半胱氨酸蛋白酶的主要成员，也是研究得最为详尽的一个家族[3]，近年来在拟南芥[4-5]、大豆[6-7]烟草[8]和水稻[9]等植物中对这类基因已有大量研究，但在小麦中报道较少。Papain家族在酶前体中已经形成大小相当的2个结构域，在这2个结构域构成的裂隙底部是催化活性位点[10]。Papain家族的各个成员含有由保守氨基酸残基组成的催化三联体，它们在肽链上的排列顺序是Cys-his-Asn/Asp[11]，Gln残基对其催化作用的发挥也很重要。酶前体通过分子内或分子间蛋白水解而激活。Zang等[12]的研究表明，小麦中TaCP为水分胁迫诱导表达的上调基因可以受脱水胁迫、盐胁迫及低温胁迫的诱导表达。马岩岩等[13]研究发现，柑橘半胱氨酸蛋白酶基因CsCysP也可以受脱水胁迫、盐胁迫及低温胁迫的诱导表达。

半胱氨酸蛋白酶家族基因目前在小麦中尚未被深入研究，主要功能还不明确。本课题组在前期工作中从小麦抗旱品种西农538中克隆出一个半胱氨酸蛋白酶基因，将其命名为TaCP3，本试验对其进行生物信息学分析、蛋白诱导表达和非生物胁迫处理，以期为在小麦中进一步研究半胱氨酸蛋白酶的功能提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

普通小麦品种西农538由国家小麦改良中心杨凌分中心品质实验室保存并提供。待小麦生长至两叶一心期，分别用20% PEG-6000、250 mmol·L-1NaCl进行干旱和高盐胁迫处理，并分别放置在4 ℃和40 ℃的光照培养箱进行低温和高温胁迫处理。从胁迫0 h开始取样(小麦叶片)，除高温胁迫处理在0、0.25、0.5、1、2、3、4和6 h取样外，其余胁迫均在0、1、3、6、12、24、48和 72 h取样。所有样品取完后均迅速放入液氮中，并在速冻后放入-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 目的基因的克隆

以室内培养至两叶一心期的西农538幼嫩叶片为材料，采用微量CTAB[14]法提取基因组DNA。根据拟南芥At1g47128序列，在NCBI上进行序列比对，结合URGI数据库比对结果，选取小麦基因组中与At1g47128相似性最高的3B染色体上的序列，命名为TaCP3。根据其序列设计特异性引物CP3-F(ATGGGGCAGCTCAGC AAGAAG)/CP3-R(TCACTGCGACTCCCATG C，以西农538的基因组DNA为模板进行扩增反应，体系与程序参考ZXEs Taq Master Mix说明书(康为世纪，北京)，其中循环数为30，退火温度为62 ℃，延伸时间为75 s。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，用DNA凝胶回收纯化试剂盒(天根，北京)回收目的片段。将回收的目的片段连接入pEASY-T1克隆载体(全式金，北京)，转化进Transl-T1感受态(全式金，北京)，涂于含有适量Amp的LB平板，37 ℃过夜培养，以通用引物M13F/M13R对单克隆菌落进行PCR扩增，筛选阳性克隆，并送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序。

1.3 生物信息学分析

利用ExPASy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)进行蛋白质基本理化性质预测；用NPS-SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)预测TaCP3蛋白序列的二级结构；用ExPASy-SWISS MODELL(https://www.swissmodel.expasy.org/interactive)预测蛋白质的三级结构；用CBS-SignalP 3.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)预测信号肽；用CBS-TargetP 1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)进行亚细胞定位。下载其他植物的半胱氨酸蛋白酶的蛋白序列，用DNAMAN进行多重序列比对；用MEGA 7软件依据Neighbor-Joining法构建系统进化树。

1.4 目的基因的诱导表达

根据测序得到的TaCP3基因序列，设计一对去除信号肽序列的表达引物RDd-F/RDd-R。以阳性克隆菌液为模板，用RDd-F/RDd-R进行PCR扩增反应，体系和程序参考KOD FX说明书(TOYOBO，日本)，其中循环数为30，退火温度为62 ℃，延伸时间为75 s。同1.2节的方法进行目的片段的回收、连接和转化，送测序。将上述测序正确的pEASY-T1/TaCP3载体中的目的片段用内切酶BamHI和HindⅢ进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后用回收试剂盒纯化，插入同样双酶切的大肠杆菌目的表达载体pcold-TF(全式金，北京)中，经T4 DNA连接酶16 ℃连接过夜，转化至感受态大肠杆菌DH5α，在含有Amp抗性的LB平板上培养，挑取阳性克隆，PCR、酶切鉴定。正确后将插入顺序正确的阳性单克隆提取质粒，转化于EscherichiacoliBL21(DE3)表达感受态(全式金，北京)，培养后挑选阳性单克隆菌落，以备重组蛋白诱导表达所用。将上一步得到的阳性单克隆菌落接种于LB液体培养基(含100 mg·mL-1Amp)，于37 ℃、200 r·min-1过夜培养。将培养物按1∶100的比例接种于5 mL含LB的液体培养基(含100 mg·mL-1Amp)中震荡培养至菌液OD600=0.5左右，取1 mL菌液作为阴性对照，向剩下的菌液中加入终浓度为0.6 mmol·L-1的IPTG，20 ℃诱导表达20 h。用12%的SDS-PAGE分析鉴定蛋白表达结果。

1.5 诱导表达产物的Western blot分析

诱导表达产物经SDS-PAGE电泳后进行转膜。在60 V电压下湿转75 min，然后取出NC膜于干净的玻璃容器中，TBS洗膜3次，每次15 min；用新配置的封闭液(含5%脱脂奶粉)室温摇床封闭2 h，弃封闭液，TBS和TBST洗膜各2次，每次15 min；以鼠抗his(1∶10 000封闭液稀释)抗体为一抗(全式金，北京)，室温摇床孵育1 h，弃一抗，TBS和TBST洗膜各2次，每次15 min；以HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶5 000封闭液稀释)为二抗(全式金，北京)，室温摇床孵育1 h，弃二抗，TBS和TBST洗膜各2次，每次15 min。

1.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒(天根，北京)提取RNA，用FastKing cDNA第一链合成试剂盒(天根，北京)进行cDNA第一链的合成。将所得cDNA于-20 ℃保存。用SuperReal 彩色荧光定量预混试剂盒(天根，北京)在Q7荧光实时定量PCR仪(ABI，美国)上进行qRT-PCR，分析TaCP3基因在上述处理各个时间点的表达情况，反应体系与程序参照说明书。以 18S RNA为内参基因，每个样品设置3个生物学重复，用2-ΔΔCt[15]法计算胁迫处理的样品和对照组样品中目标基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 目的基因的克隆与序列分析结果

以西农538基因组DNA为模板，利用引物RD-F/RD-R进行PCR扩增。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，得到约1 100 bp的单一条带。将目的条带回收、克隆和测序后，得到长度为1 125 bp的序列，比对后确定成功扩增了TaCP3的序列全长。序列分析表明，TaCP3编码374个氨基酸，相对分子质量约为40.5 kD，等电点为6.76。在NCBI蛋白数据库中进行保守结构域分析，结果显示TaCP3的N端包含一个组织蛋白酶前肽抑制剂结构域，位于TaCP3的第46～102 位氨基酸上，在部分木瓜蛋白酶家族中也存在这一结构域[16]；含有一个木瓜蛋白酶家族(papain C1) 保守结构域，位于TaCP3的第138～354位氨基酸。NPS-SOPMA预测结果表明，该蛋白主要以无规则卷曲(47.33%)和α-螺旋(33.16%)为主，含少量β-转角(5.08%)。ExPASy-SWISS MODELL分析结果表明，5egw.1.B序列与TaCP3氨基酸序列的第33～360个残基的一致性达46%，且5egw.1.B序列编码蛋白也是半胱氨酸蛋白酶家族蛋白，具备同源建模的条件。得到TaCP3基因所编码蛋白的三维结构模型。CBS-SignalP 3.0预测发现，TaCP3在N-端含有信号肽，且切割位点位于第28位和第29位氨基酸之间。结合CBS-TargetP 1.1 Server的亚细胞定位分析，表明这个蛋白可能是分泌型蛋白、胞外蛋白。在Uniprot蛋白序列库中对TaCP3的氨基酸序列进行NCBI-BLASTP同源序列比对分析，下载来自不同植物的半胱氨酸蛋白酶蛋白序列9条，用DNAMAN进行蛋白质多重序列比对(图1)，用MEGA7软件构建系统进化树。结果显示，TaCP3与同族禾本科的大麦(GenBank登录号M0Z3Q3)和山羊草(GenBank登录号N1R0h7)同源关系最近(图2)，序列相似性分别为88%和89%。

2.2 TaCP3原核蛋白表达

通过优化表达条件，在0.6 mmol·L-1IPTG、20 ℃诱导条件下诱导20 h目的蛋白表达达到高峰。表达蛋白经12% SDS-PAGE电泳显示相对分子质量约为92 kD(40 kD+52 kD，因为蛋白质标签的融合表达，因此所得的表达产物的分子量比目的蛋白大)，与推测蛋白分子质量大小相符(图3，图4)。

粗体下划线为半胱氨酸蛋白酶保守区，箭头指向TaCP3蛋白质序列 。

Multiple sequence alignment of proteins,underlined as a conserved region of cysteine protease; arrows point to TaCP3 protein sequence.

图1 TaCP3 蛋白的多重序列比对

Fig.1 Multiple sequence alignment of TaCP3 proteins

1：蛋白质分子质量标准；2：未诱导的空载体；3：IPTG诱导的空载体；4：未诱导的TaCP3重组质粒表达产物；5：IPTG诱导的TaCP3重组质粒表达产物。

1:Blue Plus II Protein Marker; 2:Protein of non-recombinant plasmid without induction; 3:Protein of non-recombinant plasmid after induced by IPTG; 4:Recombinant plasmid of TaCP3 without induction; 5:Recombinant plasmid of TaCP3 induced by IPTG.

图3 TaCP3重组质粒的SDS-PAGE分析

Fig.3 Analysis TaCP3 of recombinant by SDS-PAGE

2.3 胁迫处理下 TaCP3基因的表达

在干旱胁迫(20% PEG-6000)处理下，TaCP3在前6 h内表达量下降，于12 h表达量骤升至初始表达量的近10倍，24 h时回落至2倍初始表达量，并持续下降到72 h。在高盐胁迫(NaCl 250 mmol·L-1)处理下，TaCP3在1 h时表达量略降低，3 h时表达量上升至最大值，然后逐渐降低，至48 h时表达量低于初始表达量，在72 h时又突升接近最高表达量。冷害胁迫(4 ℃)处理下，除48 h表达量高至初始表达量，其余时间均低于初始表达量，并在24 h时达到最低，总体呈现“下降-上升-下降-上升-下降”趋势。高温胁迫(40 ℃)处理下，TaCP3表达量先下降后上升至初始表达量，然后再下降再上升至初始表达量，在 6 h 升至最高表达量。

1：IPTG诱导的空载体；2：IPTG诱导的TaCP3重组质粒表达产物。

1:Protein of non-recombinant plasmid induced by IPTG; 2:Recombinant plasmid of TaCP3 induced by IPTG.

图4 基因诱导表达产物蛋白质印迹法检测结果

Fig.4 Analysis of recombinant plasmids by Western blot

3 讨 论

本研究首次在小麦中克隆得到TaCP3基因，其氨基酸序列N端有28个氨基酸残基编码的信号肽，C端具有木瓜蛋白酶亚家族的保守结构域。与其他的木瓜蛋白酶相似，TaCP3在保守区域内也具有木瓜蛋白酶亚家族共有的活性位点Gln-Cys-his-Asn/Asp[17]。其与禾本科植物大麦和山羊草中半胱氨酸蛋白酶的相似性最高，分别为88%和89%，进化分析表明，其与大麦和山羊草中半胱氨酸蛋白酶在进化上的同源性也最高。Ao等[18]的研究也表明，禾本科的半胱氨酸蛋白酶基因是非常亲近的，在进化过程中某些物种中半胱氨酸蛋白酶基因的保守性以及这一特征可用于基因工程以改善植物的抗逆性。重组蛋白诱导表达结果显示，含有终浓度为0.6 mmol·L-1IPTG的菌液，在20 ℃下诱导20 h是最佳的诱导条件。以上为进一步研究TaCP3的酶学特征和生理功能打下了坚实的基础。

A：干旱胁迫(20% PEG-6000处理)；B：高盐胁迫(250 mmol·L-1NaCl处理)；C：冷害胁迫(4 ℃)；D：高温胁迫(40 ℃)。

A:Drought stress(treated with 20% PEG6000); B:High salt stress(treated with 250 mmol·L-1NaCl);C:Cold stress(treated with 4 ℃); D:High temperature stress(treated with 40 ℃).

图5 非生物胁迫下TaCP3的相对表达量

Fig.5 Relative expression level ofTaCP3gene under various abiotic stresses

实时荧光定量PCR结果显示，TaCP3基因在干旱、高盐、低温和高温胁迫下均可以被诱导，其中能够被干旱胁迫强烈诱导。虽然四种不同的胁迫条件下，TaCP3的响应程度和时间有所不同，但是大体呈现为“下降-上升-下降-上升”的波动表达模式。同时，不论什么胁迫处理下，在0 h后时间节点的TaCP3表达量总是先降低。Ao等[18]的研究指出，在48 h干旱胁迫期间，MwCP在4 h表达，并且表达水平在下降至6 h之前达到峰值；Jennifer和John[19]的研究发现，当豌豆植株受到水分胁迫时,Cyp15a的表达增加，在不同的胁迫条件下Cyp15a的表达量不同。在方正武等[20]的研究中，FeRD21在干旱胁迫12 h的表达量也达到了最大值；而拟南芥中的RD19A和RD21A能够被干旱和高盐强烈诱导[3]。虽然在不同物种中，干旱处理下CP家族基因响应达到表达量峰值的时间会有所不同，但是都是正向调控，会达到一个表达量的最大值。就抗旱性而言，Grudkowska和Zagdan的[21]试验结果表明，缺水时，偶氮酪蛋白活性增强，但在Kobra栽培品种(耐受性基因型)中活性增强显著较低。以往的研究表明，对脱水反应，抗旱性不同的小麦品种在水分胁迫时的表现不同。半胱氨酸蛋白酶活性优先增强，但其活性与10个春小麦品种的脱水耐性水平呈负相关[22]。此外，已有许多试验证明，干旱诱导基因也可被高盐和低温所诱导,表明这3种胁迫响应之间存在相似的机制[3]。

本试验从模拟非生物胁迫入手，证明了TaCP3是可以响应干旱胁迫、高盐胁迫、低温胁迫、高温胁迫的。但是逆境的响应是由许多基因调控的，因此半胱氨酸蛋白酶在响应逆境时的具体作用机制仍需进行进一步的研究。同时本试验中TaCP3能够响应干旱胁迫，也能够间接证明西农538是一个抗旱品种。另外试验只是证明了TaCP3可以响应四种非生物胁迫，并没有与非抗品种进行比较，不能得出TaCP3对这四种非生物胁迫的作用大小。以后可以设置抗性组和非抗组，同时进行胁迫处理，比较TaCP3的表达量差异，也可参照Zang等[12]将TaCP3转入拟南芥(Arabidopsisthaliana)进行抗旱性功能验证。