液相色谱结合多元统计分析多酚与烟叶香型的关系

陈森林 黄曼艳 林云 陶红 胡玉玲 叶为民 李攻科

摘 要 采用超声辅助萃取-液相色谱法快速测定烟叶中8种多酚类致香前体物质，通过测定51份烟叶样品中多酚类含量差异，结合主成分分析、聚类分析和判别分析等多元统计方法，对烟叶香型进行区分和判定。结果表明，前两个主成分累计贡献率为67.9%，从主成分得分图中可直观显示清香型、中间香型和浓香型的分类趋势，采用层次聚类分析可将51份烟叶样品分为3种香型，与交互验证率为90.2%的Fisher's判别分析的结果相一致。此外，研究了多酚类物质与产地的关系，主成分得分图中初步显示了不同产地烟叶的分类趋势。本研究结果表明，多酚类物质结合多元统计方法可应用于烟叶香型、产地分类的分析。

关键词 液相色谱; 多元统计; 多酚; 烟叶; 香型; 产地

1 引 言

烟叶香型是影响烟叶品质的重要因素，研究不同烟叶的香型，可为烟叶的品质提供保障。烟叶香型主要分为清香型、浓香型、中间香型和过渡香型。小分子的致香成分（如糠醛、苯乙醇、大马酮、2-乙酰基吡咯等[1]）是影响烟叶香型的直接因素，通过研究致香成分含量和组分变化，可以对烟叶香型[2]、产地[3]等进行分类。多酚是烟草重要的次生代谢物和香气前体物质，包括单宁类、香豆素类、黄酮类、花色素类等，在陈化的过程中降解生成小分子致香成分（如苯甲酸、糠醛、5-甲基糠醛、4-甲基儿茶酚等[4]），从而影响烟叶的香型和品质。

多酚类物质测定方法主要有近红外光谱法[5]、分光光度法[6]和色谱法[7]等。近红外光谱法只能单一测定某种物质，抗干扰能力弱， 且对痕量组分的定量分析不准确; 分光光度法根据吸光度的大小对多酚进行定量分析，对反应要求高，稳定性较差，更适合烟叶多酚总含量的测定; 高效液相色谱法具有稳定性高，多组分同时检测的优势，是烟叶中多酚类物质测定的常用方法[8，9]。在烟叶多酚测定的行业标准方法中[10]，仅测定了绿原酸、莨菪亭和芸香苷3种多酚。为了全面研究烟叶多酚类物质的组成，可以增加多酚类化合物的测定种类， 优化前处理过程[11]和分析方法[12]。目前，采用仪器分析方法结合多元统计方法对烟叶香型、产地等信息分类和判定，是烟草行业重要的研究手段[13，14]。通过主成分分析（Principal component analysis，PCA）和聚类分析（Cluster analysis，CA）无监督模式的识别方法，可以从主成分得分图和聚类树中直观得出未知烟叶样品的归类情况[15，16]，但无法直接对未知样品进行预测和判定。因此，需要在大量已知样品分类的基础上建立判别模型，从而预测未知的烟叶样品，如采用烟叶化学成分的特征光谱数据结合判别分析（Discriminate Analysis，DA）和偏最小二乘法（Partial Least squares method，PLS）对烟叶香型进行区分[17]，或测定烟叶样品致香成分含量的差异结合神经网络模型对库存烟叶香型进行预测等[18]，均具有良好的识别效果。小分子致香成分是影响烟叶香型的直接因素，但烟叶致香前体物质也是影响烟叶品质的重要因素，Zhang等[19]研究了氨基酸、糖苷类成分含量差异， 采用层次聚类分析和偏最小二乘法分析不同生产时期和部位的烟叶样品，从而为烟叶代谢过程分析提供依据。Xiang等[20]研究了烟叶中多酚和有机酸含量差异，结合多元统计分析，可对烟叶的产地、等级进行分类。宗浩等[21]证明了烟叶多酚不仅与烟叶的部位有关，不同香型的多酚类物质含量也有差异; 向刚等[22]建立了不同烟叶多酚类的指纹图谱，为烟叶品质的研究提供了依据; 常爱霞等[23]研究了多酚类物质与香型的相关性，结合聚类分析成功地对烟叶产地进行了区分。

本研究建立了超声辅助液液萃取-高效液相色谱快速测定烟叶中8种多酚类物质的方法，采用主成分分析、聚类分析和判别分析法研究了以烟叶多酚类物质含量差异对3种不同香型烟叶分类和判别的可行性，探究了烟叶多酚类物质与产地的关系。研究结果表明，本方法具有良好的分类效果。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

LC-2010C高效液相色谱仪（日本岛津公司），配紫外检测器; H1850高速离心机（湖南湘仪离心机有限责任公司）; AB204-S电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）; KQ5200数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）; 0.22 μm聚四氟乙烯过滤器（上海安谱科学仪器有限公司）。

新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、莨菪亭、芸香苷、莰菲醇-3-O-芸香糖苷标准品（纯度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）; 甲醇（色谱纯，DIMA公司）; 乙酸（色谱纯，Sigma公司）; 烟叶样品由广东中烟公司提供。

2.2 色谱条件

Diamonsil C18色谱柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）; 流动相A为0.5%乙酸溶液，流动相B为0.5%乙酸-甲醇溶液，梯度洗脱程序： 0～5 min， 80% B，5～35 min，80%～25% B; 柱温： 30℃; 检测波长328 nm; 进样量20 μL; 流速1 mL/min。

2.3 标准溶液和样品溶液制备

准确称取新绿原酸（8.8 mg）、绿原酸（23.5 mg）、隐绿原酸（10.2 mg）、咖啡酸（28.1 mg）、良菪亭（26.3 mg）、香豆素（33.7 mg）、芸香苷（25.6 mg）、莰菲醇-3-O-芸香糖苷（5.2 mg），用甲醇溶解并定容至25 mL，于4℃避光保存。配制标准溶液时，采用逐级稀释法配成一系列浓度的混合标准溶液。

将烘干的烟叶样品磨成粉末，过40目筛使用。称取50 mg干燥后烟末样品，加入10 mL甲醇-水（2∶3，V/V）摇匀，超声提取20 min，以8000 r/min离心5 min，上清液經0.22 μm滤膜过滤后，进样分析。

2.4 数据处理

应用SPSS-24软件进行主成分分析、层次聚类分析和判别分析。取51份不同香型烟叶样品（具体信息见电子版文后支持信息表S1），其中，1～18号为清香型、19～35号为中间香型，36～51号为浓香型，各样品的多酚类物质平均含量请见电子版文后支持信息表S2; 另外，取53份不同产地（湖南、云南、贵州）的烟叶样品，采用相同的方法对烟叶的产地进行初步区分，其中1～22号产自湖南，23～42号产自云南， 43～53号产自贵州，各样品的多酚类物质平均含量请见电子版文后支持信息表S3。

3 结果与讨论

3.1 色谱条件和前处理条件优化

优化了色谱流动相，流动相A和B分别采用0.5%乙酸溶液和0.5%乙酸-甲醇溶液时，方法具有良好的稳定性和分离效果。对萃取溶剂比、超声时间等前处理条件优化，最终确定萃取溶剂为甲醇-水（2∶3， V/V），超声时间为20 min，可简单快速提取烟叶中的多酚类化合物。在最佳条件下的烟叶样品色谱图如图1a，多酚类标准溶液色谱图如图1b。

3.2 方法评价

分别配制8种多酚类物质的系列标准浓度，采用外标法进行定量分析， 结果见表1。 8种多酚类物质具有较宽的线性范围，线性相关系数R2为0.9990～0.9998，检出限为0.0022～0.0044 mg/g，方法回收率为80.1%～104.1%，相对标准偏差为2.2%～6.6%，满足前处理和分析检测方法的要求，可用于烟叶样品中多酚类物质的测定。

3.3 主成分分析

主成分分析（PCA） 是将多个变量通过线性变换以选出较少个数重要变量的多元统计分析方法，将原始数据降维后得到主要的因子变量，以降低数据的复杂度[24]。将得到的多酚类数据进行归一化处理后进行主成分分析，从因子载荷图（图2B）可见，8种多酚类物质对烟叶香型的分类均具有重要作用，得到的主成分F1和F2是原8种多酚类物质的线性组合。主成分得分图（图2A）中前2个主成分F1和F2累计贡献率为67.2%，可将烟叶样品分为3种不同的香型，且中间香型介于清香型和浓香型之间，存在一定的交叉结果，证明了根据多酚类物质判别烟叶香型分类的可行性。从因子载荷图（图2B）可见，绿原酸及同分异构体和芸香苷含量是影响主成分F1的主要因素，且仅莨菪亭含量与F1呈负相关;咖啡酸、莨菪亭和莰菲醇-3-O-芸香糖苷含量是影响主成分F2的主要因素，且绿原酸和莰菲醇3-O-芸香糖苷含量与F2呈负相关。主成分分析是一种无监督的模式识别方法，忽略变量之间的相关性，通常可与聚类分析、判别分析联用，增加结果的准确性[25，26]。

3.4 聚类分析

聚类分析作为一种无监督模式的分类方法，根据样品含量的差异进行归类，将具有相似性质的样品归为一类，从而在聚类树图中直观看出每个样品的分类信息，广泛用于茶叶和烟叶品种和地域分类[27，28]。本研究采用The Ward系统聚类法，聚类距离采用欧氏距离，以51种烟叶样品的酚类含量数据为变量，对3种不同香型的烟叶样品进行聚类分析，结果如图3所示，在T=9时，烟叶香型被分为三大类，其中一类是1～18号（除3、11号）烟叶样品，另一类是19～35号（除25、29号）和43号样品，其余的归为第三类。与已知烟叶样品的香型进行对比，其分类的准确率达到了90.8%，进一步直观地说明了根据烟叶多酚类含量的差异结合聚类分析可以对烟叶香型进行分类，分类效果良好。

3.5 判别分析

判别分析作为一种监督模式的识别方法，通过已知样品的分类信息建立判别模型， 可以对未知样品进行预测和判定。以测得的多酚类物质含量建立Fisher's判别模型， 对3种不同香型的烟叶进行分类。从图4判别分析得分投影图中可以直观看出组内聚类情况和组间距离大小，3种香型的种群相对集中，基本上实现分离。分别运用自身验证法和交互验证法对原样品进行回判，由于交互验证法采用刀切法进行回代判别，有利于降低用全部数据建立判别函数后再对全部样品进行回代判别（即自身验证法）产生的偏差，运用交互验证法常能得出较自身验证法更高的准确率，增加可信度。烟叶样品回代判别的结果见表2。在自身验证中，第1组清香型烟叶回代判别准确率为94.4%，其中1份样品误判为第2组; 第2组中间香型回代判别准确率为941%，其中1份样品误判为第3组; 第3组浓香型回代判别准确率为100%，最终得出3组香型的平均准确率为96.1%。同理计算出交互验证法的平均回代判别准确率为90.2%。两种验证方法证实了利用烟叶多酚类物质含量的差异可对不同香型的烟叶样品进行判定，从而实现对某一未知香型的烟叶样品的预测。

3.6 烟叶多酚类与产地关系的初步探究

測定了53份不同产地烟叶样品多酚类物质的含量，其数据进行归一化处理后，采用主成分分析法对烟叶产地进行初步探究。 从图5可见，提取的3个主成分的累计贡献率为78.4%，3种地域有分类的趋势，但是湖南烟叶主成分得分较分散，可能是因为湖南地区的烟叶种植地区较分散，导致酚类含量的差异较大;其次， 还可以控制烟叶测定的部位，使测定的结果有更好的分类效果。图5的结果初步表明，多酚类致香前体物质与烟叶产地具有相关性。

4 结 论

采用超声萃取-液相色谱法测定了烟叶中8种多酚类致香前体物质，方法简单快速，具有良好的稳定性和精密度，可用于多酚类物质测定。利用主成分分析、聚类和判别分析方法对多酚类物质含量的差异进行分析， 实现对烟叶的香型和地域的分类和判定，推测多酚类物质与烟叶香型、产地的相关性，为烟叶香型和产地的研究提供了新的研究思路，从而为烟叶品质研究提供更多的依据。

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