铁基纳米粒子制备及用于pH响应双模态磁共振成像引导下肿瘤光热治疗

刘建华 王雷 张天琪 王建秋 龚雪 崔凤至 郑建军 李波 施展

摘 要 肿瘤早期诊断对于选择合适的治疗方案至关重要，而单一模态磁共振成像（MRI）难以满足精确诊断的要求。本研究构建了聚丙烯酸（PAA）修饰的Fe3O4@MnO2纳米粒子（Fe3O4@MnO2@PAA）用于pH响应的T1/T2双模态MR成像，同时能够介导肿瘤的光热治疗。以Fe3O4为核，可以使Fe3O4@MnO2@PAA纳米粒子在磁共振成像的T2信号明显减低; MnO2纳米壳在肿瘤内的酸性环境下可分解为顺磁性的Mn2+，能够增强T1信号。这种pH响应的T1/T2双模态MRI造影剂具有良好的敏感性和特异性，可以为肿瘤诊断提供更全面、更详实的信息。此外，Fe3O4@MnO2@PAA纳米粒子在近红外区表现出优异的吸收能力，可作为一种良好的光热转换材料介导肿瘤的光热治疗。这种pH响应的双模态磁共振成像介导光热治疗的新型纳米诊疗剂，在肿瘤的MRI诊断及光热治疗方面表现出良好的应用潜能。

关键词 诊疗剂; 磁共振成像; 双模态成像; 近红外光; 光热治疗

1 引 言

磁共振成像（MRI）已经广泛应用于临床医疗，这种影像学检查方法对肿瘤的早期诊断及鉴别诊断具有非常明显的优势，对于选择合适的治疗手段至关重要。相比于其它的影像学检查方法，如超声（US）、X线平片（DR）、X线计算机断层摄影（CT）及正电子发射断层扫描（PET）等方法，MRI具有更高的图像分辨率以及空间分辨率，同时无电离辐射污染[1]。在临床上，为了提高MRI检查的准确性，通常引入造影剂强化病灶部位的磁共振信号，使得病灶部位与正常部位之间的边界更为清晰[2]。目前，最常用的MRI造影剂是钆离子螯合物，应用于T1加权成像，能够缩短氢质子在外加磁场下的纵向弛豫率[3]。但是，这种离子型造影剂的分布明显受到血流量影响，其信号增强的效果不仅出现在肿瘤部位，由炎症、外伤所导致的充血水肿部位也会出现异常强化的高信号[4，5]。病灶的非特异强化使得传统钆基造影剂难以区分某些恶性肿瘤和良性疾病。此外，FDA曾报道含钆造影剂可以在体内沉积，不仅能够损伤中枢神经系统，还可以诱发肾源性系统纤维化，甚至造成死亡等不良后果[6]。这些潜在风险已经引起了广泛关注，因此， 新的MRI造影剂的研制成为目前的研究热点。

为了获得更精确的诊断信息、构建有响应性成像能力的造影剂，肿瘤微环境的影响不容忽视。肿瘤微环境与正常组织之间差异很大，肿瘤内部组织代谢快，因此造成酸性物质堆积、乏氧状态及H2O2富集等[7，8]。其中，针对肿瘤微环境内低pH值响应的MRI造影剂引起了研究者的广泛关注，因为各种类型以及不同分期的肿瘤，内部都呈现酸性[9～13]。近几年，以MnO2纳米壳作为一种理想的pH响应T1加权MRI造影剂越来越受到关注，因为MnO2纳米壳在肿瘤酸性环境下可以分解为顺磁性的Mn2+，使得T1信号增强[14～16]。另一方面，即使MnO2纳米壳在血流量丰富的非肿瘤部位聚集，也不会引起相应部位的信号异常增高，因此提高了造影剂的灵敏度和特异性。然而，单一模态的T1加权MRI并不能提供全面的诊断信息，如果融合其它的影像手段，如US、DR、CT或者PET，由于成像模式和成像机制不同，造成时间及空间误差，丢失大量有用信息[17]。构建pH响应T1/T2成像MRI造影劑可以实现在单一设备上的双模态成像，弥补上述不足。

本研究成功构建了聚丙烯酸（PAA）修饰的Fe3O4@MnO2壳-核结构，以Fe3O4为核心， MnO2为纳米壳，形成了具有良好稳定性的Fe3O4@MnO2@PAA纳米造影剂。这种新型的pH响应T1/T2双模态MRI造影剂可以实现在肿瘤微环境中产生顺磁性Mn2+，增强T1信号; 此外，Fe3O4能够在T2加权像上更好地区分肿瘤与正常组织之间的边界，提供更准确的信息。更重要的是，Fe3O4@MnO2@PAA纳米粒子在近红外区具有优异的吸收性质，因此具备良好的光热转换性能。这些优良的特性使得Fe3O4@MnO2@PAA纳米粒子有望成为一种有良好发展前景的纳米诊疗剂。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Bruker Vertex 70 光谱仪、D8 Foucs粉末X线衍射仪（德国布鲁克公司）S-4800场发射扫描电镜（日本日立司株式会社）; G2-F20场发射透射电镜（美国FEI公司）; iCAP6300电感耦合等离子体-发射光谱仪（美国赛默飞世尔公司）; Aglient Gary 60紫外-可见分光光度计（美国瓦里安公司）; 808 nm激光器（中国海特光电有限公司）; 3.0 T Discovery MR750 w核磁共振仪（美国通用电气公司）; Bruker 400 MHz超导核磁共振波谱仪（瑞士布鲁克拜厄斯宾公司）; Zeta电位测试仪（英国马尔文公司）; FLIR T420近红外热成像照相机（美国福禄克公司）。

FeCl3·6H2O、KMnO4、乙酸钠（NaAc）、乙醇、乙二醇，乙二胺、聚丙烯酸（PAA）、聚烯丙胺盐酸盐（PAH）和2-（N-吗啉）乙磺酸（MES）购于上海麦克林生化试剂公司; 细胞计数试剂盒（CCK-8试剂盒）购自大连美伦生物技术有限公司。所用试剂均为分析纯。

2.2 实验方法

2.2.1 Fe3O4纳米粒子的制备 参照文献[18]的方法构建粒径均一的磁性Fe3O4纳米粒子。首先，将40 mL乙二醇、20 mL乙二胺混合搅拌10 min，然后加入2.0 g FeCl3·6H2O和6.0 g NaAc，剧烈搅拌1 h， 将混合溶液移入100 mL的水热反应釜，200℃反应24 h，得到Fe3O4纳米粒子，用乙醇、去离子水反复洗净，分散在去离子水中，待用。

2.2.2 Fe3O4@MnO2纳米粒子的制备 参照文献[19]的方法合成Fe3O4@MnO2纳米粒子。首先，将制备的Fe3O4纳米粒子（10 mmol/L， 10 mL）分散在100 mL MES缓冲溶液（0.1 mol/L， pH 6.0）中，混匀后，在超声下加入KMnO4（10 mmol/L， 25 mL），反应40 min，将得到的棕黑色沉淀物用去离子水洗净。

2.2.3 PAA修饰Fe3O4@MnO2纳米粒子的制备 采用层层自组装方法[20] 在Fe3O4@MnO2纳米粒子表面修饰PAA。首先，将携带负电荷的Fe3O4@MnO2纳米粒子用携带正电荷的聚合物PAH包裹，然后用带负电荷的阴离子聚合物PAA再次包裹，所形成的Fe3O4@MnO2@PAA纳米粒子具有良好的分散性。

2.2.4 活体实验 Balb/c小鼠（18～23 g）购自于长春亿思实验动物科技公司。在小鼠后腿前方皮下注射4T1细胞，建立肿瘤模型，待肿瘤体积达到80～110 mm3可以用于实验测试。所有的动物操作均按照中国实验动物条例进行，并获得伦理审批。

2.2.5 细胞毒性评价 应用CCK-8试剂盒评价Fe3O4@MnO2@PAA纳米粒子的细胞毒性。将人类乳腺癌细胞（MCF-7）接种于细胞培养板，在37℃，5% CO2条件下培养24 h。加入不同浓度的Fe3O4@MnO2@PAA纳米粒子（0～200 μg/mL， 100 μL/孔），继续培养24 h后，加入CCK-8试剂继续培养，测定吸光度。

2.2.6 体外及体内的磁共振检测 Mn2+和Fe3O4纳米粒子分别具有T1加权像和T2加权像的MRI效果，应用3.0 T临床MRI扫描仪评价Fe3O4@MnO2@PAA纳米粒子的成像效果。首先，将Fe3O4@MnO2@PAA纳米粒子按照不同浓度梯度分散在不同pH值的PBS缓冲溶液中，分别设置pH 5.0 和7.4两种条件模拟肿瘤内部的酸性环境和人体的正常组织环境。Fe3O4@MnO2@PAA纳米粒子的浓度通过ICP原子发射光谱法测定，分别为Mn2+：0～0.32 mmol/L， Fe3O4： 0～1.4 mmol/L。

体内MRI测试采用Balb/c小鼠进行，荷瘤小鼠麻醉下通过尾静脉注入不同浓度的Fe3O4@MnO2@PAA NPs （400 μg/mL，150 μL），在不同的时间点（0、1、2、3、5、12、24、48 和 96 h）記录小鼠肿瘤部位的T1和T2图像。以400 μg/mL的浓度对Balb/c荷瘤小鼠进行瘤内注射，并获得肿瘤部位注射前后的图像。T1加权扫描的图像参数：TR=569 ms， TE=20.7 ms， FOV=200 × 200 mm。T2加权扫描的图像参数：TR=7279.8 ms， TE=115 ms， FOV=240 × 240 mm。

2.2.7 体内光热成像测试 荷瘤小鼠随机分为实验组及对照组，实验组采用Fe3O4@MnO2@PAA纳米粒子 （800 μg/mL， 0.15 mL）瘤内注射，空白对照组采用相同体积的PBS缓冲液瘤内注射。然后，对每只小鼠的肿瘤部位进行808 nm近红外光照（1.3 W/cm2， 10 min），用红外照相机记录肿瘤部位的温度变化。

2.2.8 细胞光热治疗 MCF-7细胞接种细胞培养板中，在37℃、5% CO2条件下培养24 h，保证细胞贴壁，然后加入不同浓度的Fe3O4@MnO2@PAA纳米粒子（0～400 μg/mL） 继续培养3 h。用808 nm激光（1.3 W/cm2）照射每个孔10 min，用CCK-8试剂盒检测细胞存活情况。

3 结果与讨论

3.1 Fe3O4@MnO2@PAA纳米粒子的表征

采用溶剂热方法合成了Fe3O4纳米粒子，对其进行SEM和TEM扫描，可见此纳米粒子呈较均匀的球体，直径约45 nm（图1A）。与KMnO4反应后，在Fe3O4表面成功生成了MnO2壳，透射电镜的检测结果显示壳厚度约为25 nm（图1B）。如图1C～1F所示，通过HAADF-STEM能谱扫描元素分布可知，纳米粒子中的Fe元素均匀分布在核心区域，Mn元素位于表面，而O元素分布于整个纳米粒子中，证实了Fe3O4@MnO2的壳-核结构。XRD表征结果中，位于36.8°和65.8°的峰位再次证明了MnO2壳的存在（图2A）[21]。为了提高Fe3O4@MnO2纳米粒子的分散性和生物相容性，采用携带不同电荷的聚合物对其进行修饰，Zeta电位测试结果见图2B，Fe3O4@MnO2， Fe3O4@MnO2@PAH， Fe3O4@MnO2@PAA 表面的电位分别为15.5 mV、+16.3 mV和11.3 mV，证实纳米粒子表面覆盖了聚合物涂层。

Fe3O4@MnO2@PAA纳米粒子在近红外区有较强的吸收（图3A），具有作为肿瘤光热治疗介质的潜能。为了进一步探究其光热性能，将不同浓度的Fe3O4@MnO2@PAA纳米粒子置于808 nm波长的激光器下进行照射（1.3 W/cm2， 10 min）。照射期间，Fe3O4@MnO2@PAA 纳米粒子水溶液（400 μg/mL） 的温度从23.2℃上升至54.4℃，温度上升曲线如图3B所示，值得注意的是，在相同的实验条件下，去离子水的温度变化并不明显，说明Fe3O4@MnO2@PAA 纳米粒子在照射过程中将光能转换为热能并释放出来。这种良好的光热转换能力表明Fe3O4@MnO2@PAA 纳米粒子具备肿瘤光热治疗的性能。

3.2 细胞毒性

细胞毒性是评价纳米材料能否应用于生物体内的重要指标。采用CCK-8试剂盒检测Fe3O4@MnO2@PAA纳米粒子的毒性。将MCF-7细胞培养24 h后，加入不同浓度的Fe3O4@MnO2@PAA纳米粒子（6.25～200 μg/mL），继续培养24 h后，细胞存活率均在90%以上（图4），其结果证实Fe3O4@MnO2@PAA纳米粒子无明显细胞毒性，可用于进一步的pH响应T1/T2双模态成像及肿瘤光热治疗。

3.3 pH响应的MRI体外成像

為了评价Fe3O4@MnO2@PAA纳米粒子作为pH响应的T1/T2双模态MRI造影剂的成像能力，选择pH 7.4的纳米粒子溶液模拟正常组织内环境，选择pH 5.0的纳米粒子溶液模拟肿瘤微环境，并采用3.0 T的医用核磁共振仪进行检测，影像结果如图5A及5B所示。MnO2纳米壳在pH 7.4和5.0的不同条件下，成像效果差异显著，正常体内环境下的MnO2纳米壳稳定性较好，没有产生增强效果。在酸性环境下，MnO2纳米壳发生解离，释放出顺磁性的Mn2+，产生明显的T1强化信号。随着Fe3O4@MnO2@PAA 纳米粒子浓度增加，Fe3O4由于内在的固有磁性，并没有受到pH值改变的影响，在两组pH条件下都显示了优异的T2增强效果，从另一个侧面证实了Fe3O4核比较稳定，不会受到pH值的明显影响。为了量化评估纳米粒子的强化能力，应用超导磁共振波谱仪测量造影剂的弛豫值，如图5C及5D所示，在pH 5.0的条件下，其纳米壳分解为顺磁性的Mn2+，纵向弛豫值（r1）为9.456 L/（mmol s），具有良好的纵向弛豫率。此外，Fe3O4纳米粒子的横向弛豫值（r2）为162.32 L/（mmol s）。以上数据表明， Fe3O4@MnO2@PAA 纳米粒子具有优异的核磁成像效果及弛豫率。

3.4 pH响应的活体成像

进一步探究了Fe3O4@MnO2@PAA 纳米粒子在小鼠活体内的成像效果。荷瘤小鼠麻醉后先进行T1、T2加权像MRI扫描，将图像作为阴性对照，随后在肿瘤部位瘤内注射Fe3O4@MnO2@PAA 纳米粒子。如图6A和6B所示，肿瘤部位在T1加权像的亮度明显增加，T2加权像的亮度明显减低，证实瘤内原位注射具有较好的T1及T2加权像效果。为了评估造影剂在体内是否具备MR双模态成像能力，将Fe3O4@MnO2@PAA 纳米粒子经小鼠尾静脉注射，在不同时间点对其进行MRI扫描，结果如图7所示，在注射后的96 h内肿瘤部位T1信号的亮度逐渐增加，T2信号的亮度逐渐变暗，与注射前阴性对照相比均发生变化。此外，如图8所示，小鼠肝脏MRI信号在注射给药前后也发生了变化，随着时间推移，肝脏信号在T2加权像上逐渐变黑，表明Fe3O4@MnO2@PAA 纳米粒子随血液循环流经肝脏，并逐渐被肝细胞摄取。

3.5 光热成像及治疗

进一步研究Fe3O4@MnO2@PAA 纳米粒子光热成像及治疗效果。随机选择两组荷瘤小鼠，实验组在肿瘤部位注射Fe3O4@MnO2@PAA 纳米粒子，空白对照组注射PBS缓冲溶液。如图9A所示，在相同条件下，经808 nm激光（1.3 W/cm2， 10 min）照射后，空白对照组温度无明显上升，而实验组肿瘤部位的温度上升20℃，达到了杀死肿瘤细胞的有效温度。为了评估其肿瘤细胞光热治疗效果，将材料与细胞培养基混合后孵育MCF-7细胞，用808 nm激光（1.3 W/cm2， 10 min）照射所有细胞。如图9B所示，与空白对照组相比，实验组肿瘤细胞死亡率随Fe3O4@MnO2@PAA 纳米粒子的浓度增高而上升，表明此纳米粒子具备肿瘤细胞的光热治疗能力。

4 结 论

成功合成了Fe3O4@MnO2@PAA的壳-核结构，此纳米材料具备pH响应T1/T2双模态MRI介导肿瘤光热治疗的功能。Fe3O4核赋予了Fe3O4@MnO2@PAA纳米粒子的磁共振T2成像能力，MnO2纳米壳具有pH调控的T1加权成像能力。同时， Fe3O4@MnO2@PAA纳米粒子在近红外区的吸收能力，使其具有良好的光热性能，能够达到杀死肿瘤细胞的目的。这种pH响应T1/T2双模态MRI介导光热治疗的纳米诊疗剂有良好的发展前景，为肿瘤的诊断和治疗提供了新的思路和方法。

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