杂交石斑鱼和母本褐点石斑鱼转录组测序及差异表达基因分析

林明德，陈 刚，马 骞，王忠良，张健东，谢瑞涛,2，汤保贵，黄建盛，周 晖，施 钢，潘传豪，ERIC Amenyogbe，邓文鑫,3



杂交石斑鱼和母本褐点石斑鱼转录组测序及差异表达基因分析

林明德1，陈 刚1，马 骞1，王忠良1，张健东1，谢瑞涛1,2，汤保贵1，黄建盛1，周 晖1，施 钢1，潘传豪1，ERIC Amenyogbe1，邓文鑫1,3

（1. 广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088；2. 广东恒兴饲料实业股份有限公司 / 3. 广东粤海饲料集团公司，广东 湛江 524000）

【】筛选褐点石斑鱼（）及其杂交子一代（♀×♂，F1）的差异表达基因，探讨褐点石斑鱼及F1代之间的生长差异性。【】采用Illumina HiSeq 2000测序平台对同龄的褐点石斑鱼及其杂交F1的脑、肝脏和肌肉组织进行转录组测序，通过edgeR软件包筛选差异表达基因，并对差异表达基因进行GO（Gene Ontology）功能注释和KOG注释，最后通过实时荧光定量PCR验证转录组数据。【】测序的原始数据经过质量控制和组装共得到54 610条unigenes。组装的unigenes共有28 832条unigenes得到注释，共获得20 234条差异表达基因，其中有10 218条上调，10 016条下调。GO功能注释显示共34 061条unigenes聚类到涉及生物过程、分子功能和细胞组分的53个功能类别，其中被较多基因聚类到的功能类别为细胞过程、结合、单一生物过程、代谢过程和催化活性等。KOG注释发现，42 753 unigenes被注释到25个功能类别中，其中较多涉及信号转导机制、基因功能预测、翻译后修饰，蛋白质周转和分子伴侣、转录等。进一步筛选到一批和生长相关的差异表达基因，如、、、、等，这些差异表达基因在F1中的表达水平均高于其亲本褐点石斑鱼，与杂交F1相较于褐点石斑鱼生长快速的性状相符。【】研究完成了对褐点石斑鱼及其杂交F1的转录组测序、组装，获得了测序数据在不同数据库的功能注释信息，同时筛选了一批生长相关差异表达基因，这些基因在F1中的表达水平均高于其亲本褐点石斑鱼，与现实生长性状相符。

褐点石斑鱼；杂交石斑鱼；转录组测序；比较分析；生长相关基因

石斑鱼隶属于鲈形目（Perciformes），鮨科（Serranidae），石斑鱼属（），是我国沿海地区重要的养殖品种，该鱼营养价值高，味道鲜美[1]。然而，近些年来，石斑鱼的种质资源退化，养殖病害频发，极大地限制了石斑鱼养殖业的健康发展[2]。目前，在石斑鱼育种中，应用杂交技术培育得一些优良的杂交品种。James等[3]研究表明褐点石斑鱼（♀）×清水石斑鱼（♂）杂交子一代（下称F1）即表现出了比其母本褐点石斑鱼更快速的生长特性。然而，对于这种生长差异性的机制尚未明确。高通量转录组测序（RNA-sequencing，RNA-seq）技术的发展，为探究这种生长差异性的分子机制提供了一个强有力的工具[4]。

近几年在水生生物鱼类中已经开展较多的比较转录组研究，Sun等[5]通过比较转录组分析了杂交石斑鱼（♀ ×♂）较之母本褐点石斑鱼和父本鞍带石斑鱼（）生长快速的分子机制。Wang等[6]通过鞍带石斑鱼注射溶藻弧菌和注射TSB的转录组差异的转录组测序研究了鞍带石斑鱼的免疫应答机制。Liu等[7]通过转录组研究了鞍带石斑鱼感染巨型细胞病毒和石斑鱼虹彩病毒之间基因表达动力学的相似性和差异性。Gao等[8]研究了云纹石斑鱼（）低盐胁迫下的肝脏中全局基因表达的变化。Kelli等[9]使用转录组分析了点带石斑鱼（）变态发育前中后的消化过程，发现了一大批摄食和消化相关的转录本。Fan等[10]研究赤点石斑鱼（）未成熟和成熟雄性和雌性成体中两种组织的转录组，探索雄性和雌性香港石斑鱼之间的下丘脑和垂体的基因表达模式。上述石斑鱼的转录组研究，极大地丰富了石斑鱼的遗传资源，但目前针对两种石斑鱼比较转录组分析的研究报道较为鲜见。本研究采用Illumina HiSeq 2 000测序平台对杂交石斑鱼和褐点石斑鱼的脑、肝脏和肌肉组织的混合样品进行转录组测序，筛选与生长相关的差异表达基因，并对差异表达基因进行功能注释和分析，探讨母本褐点石斑鱼及其F1的生长差异性的分子基础，以期为石斑鱼的杂交育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

F1的母本褐点石斑鱼（5龄）为广东海洋大学水产学院鱼类种子工程与养殖团队繁育的第3代群体，父本清水石斑鱼（5龄）从海南省俊泓实业有限公司购进，于2016年6月在东海岛基地进行同批次繁育，繁育的育苗先后在露天的水泥池培养40 d，之后转移到室内水泥池培养5个月，每天投喂3次并清理残饵粪便，更换天然海水。养殖水体pH为8.0~8.2，盐度为25~28，溶氧＞5 mg/L，光照为自然光。

采样前24 h停止投喂，杂交石斑鱼和褐点石斑鱼分别取8尾测量体质量、体长（全长）并记录，F1平均体长（22.7 ± 1.23）cm，平均体质量（233.7 ± 8.96）g，褐点石斑鱼平均体长（18.2 ± 0.45）cm，平均体质量（181.7 ± 4.5）g。使用丁香酚麻醉后解剖，取F1和褐点石斑鱼的脑、肝脏和肌肉组织，放入加有1 mL RNA保护液（SIGMA，Germany）的离心管中，于4℃冰箱冷藏24 h后，转移至-80℃超低温冰箱长期保存。

1.2 组织总RNA的抽提和测序文库构建

从超低温冰箱中分别取出褐点石斑鱼及其杂交F1的脑、肝脏和肌肉组织各8个，使用MagZol Reagent（广州美基生物科技有限公司）试剂盒进行抽提。总RNA的浓度通过Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白测定仪（Thermo Scientific, USA）进行测量，RNA完整性则通过Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies, CA，USA）进行检测，RNA分子完整数（RNA integrity number，RIN）在7~10为合格。检测合格的样品保存在-80℃超低温冰箱备用。

质量检测合格的RNA样品将用于cDNA测序文库的构建，褐点石斑鱼肌肉（HM）、肝脏（HL）、脑（HB），以及杂交F1代肌肉（SM）、肝脏（SL）、脑（SB）样品组分别各由8例合格样品混合建库。文库的构建按照TruSeq DNA Library Prep Kit（Illumina，USA）的说明书进行。用带有Oligo（dT）的磁珠分离出真核生物的mRNA。添加破碎缓冲液fragmentation buffer将mRNA打断成短的片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I 合成第二条cDNA链。在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加poly（A）并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩增。建好的测序文库在Illumina HiSeq 2000平台进行测序。测序工作委托广州基迪奥生物科技有限公司完成。

1.3 转录组测序、数据质量控制和组装

测序得到的原始数据为raw reads，经过初步过滤后为clean reads，进一步去除含接头（adaptor）、N的比例大于10%以及低质量的（质量值≤20的碱基数占整个read的40％以上）reads，最终得到高质量的干净读长（clean reads）。使用短reads组装软件Trinity-v2.7.0做转录组从头组装[11-12]。组装得到的序列称为unigene。

1.4 基因功能注释

组装得到的unigenes通过blast程序（e-value≤10-5）注释到SwissProt，NCBI non-redundant protein（Nr），KEGG 和KOG数据库。利用Blast2GO v2.5将通过Nr数据库注释的unigenes进行Gene Ontology（GO）注释[13-14]。

1.5 基因表达量统计和差异表达分析

unigenes表达量的计算使用 RPKM 法（Reads Per kb per Million mapped reads）进行[15]，样品间差异统计使用FDR 与 log2Fold Change（log2FC）来筛选，筛选条件为false discovery rate（FDR）<0.05 且|log2FC|>1。

1.6 差异表达基因的富集分析

得到差异表达基因之后，对差异表达基因做GO功能分析和KEGG通路分析。GO富集分析通过topGO R数据包基于Kolmogorov-Smirnov检验进行，KEGG通路分析通过KOBAS version 2.0完成[16]。以-value≤0.05为阈值，满足此条件的GO term和Pathway定义为在差异表达基因中显著富集的GO term和Pathway。

1.7 实时荧光定量PCR验证

为了验证转录组测序结果的可靠性，随机选取12个表达量较高的差异表基因，设计引物，以β-肌动蛋白（beta-actin）作为内参，对褐点石斑鱼及其杂交F1进行实时荧光定量PCR验证。提取褐点石斑鱼及其杂交F1的脑、肝脏和肌肉组织的总RNA，反转录为cDNA模板进行荧光定量PCR，荧光定量PCR实验具体操作按照全式金TransStart®Tip Green qPCR SuperMix说明书（北京全式金生物技术有限公司）进行，采用三步法在LightCycler96荧光定量PCR仪进行，每个实验样品检测3次。实验结果用SPSS 20.0进行分析，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量，并将相对表达量和转录组测序结果进行比较。

2 结果和分析

2.1 RNA抽提、转录组测序和组装

F1和褐点石斑鱼各组织的测序数据质量控制如表1所示。用于转录组测序的RNA数量和质量检测，各组织的RIN值均符合标准，说明RNA的完整性较好，满足建库测序的要求。通过过滤分别得到7 581 722 449，6 330 804 586，8 175 941 387，6 343 265 141，6 229 084 451，7 197 785 696 bp的clean reads。这些干净读长的20和30分别在96%和89.88%以上，GC含量在40%~60%之间，说明石斑鱼转录组测序的质量较好。

表1 测序数据控制

注：20指质量值大于或等于20 的碱基所占的百分比；30指质量值大于或等于30 的碱基所占的百分比；GC 含量为测序数据中G 和C 两种碱基所占总碱基的百分比

Note：20refers to the percentage of bases with a mass value greater than or equal to 20;30refers to the percentage of bases with a mass value greater than or equal to 30; GC content is the percentage of the total base of the bases of G and C in the sequencing data.

使用短reads组装软件Trinity-v2.8.4做de novo组装后，共得到54 610条unigenes，GC含量为46.666 5%，N50为2 718，平均长度为1 357，总数据量达到74 119 587 bp。

2.2 功能注释

通过blast程序（值≤10-5）对组装得到的54 610条ungenes进行Nr、Swissprot、KOG和KEGG四大数据库功能注释，共有28 832条unigenes注释到Nr（99.90%），Swissprot（81.50%），KOG（65.46%）和KEGG（59.11%）数据库。

从图1可知，使用blast对组装得到的54 610条ungenes进行功能注释，共有28 832条unigenes注释到Nr（99.90%），Swissprot（81.50%），KOG（65.46%）和KEGG（59.11%）数据库。将54 610条unigenes进行GO分析，共有34 061条unigenes在生物过程、细胞组分和分子功能的3个大类别的53个功能分支中得到注释。在生物过程方面，较多的unigenes聚类到细胞过程（cellular process）、单一生物过程（single-organism process）、代谢过程（metabolic process）和生物调控（biological regulation）等。对于细胞组分，细胞（cell），细胞分（cell part）、生物膜（membrane）、生物膜部分（membrane part）和细胞器（organelle）等聚类的unigenes较多。在分子功能方面，结合（binding）和催化活性（catalytic activity）是聚类较多unigenes的功能类别。

将得到的unigenes进行KEGG分析，共有7 452条差异表达基因得到功能注释，被分配到217个代谢通路中。涉及基因数量较多的通路是神经活性配体-受体相互作用、内吞作用、MAPK信号通路、粘着斑、钙信号通路、肌动蛋白细胞骨架的调控等（表2）。

2.3 差异表达基因的筛选

根据FDR < 0.05且|log2FC|>1的标准，在褐点石斑鱼和杂交F1的各组织筛选到的差异表达基因结果如图2所示。相较于褐点石斑鱼，杂交F1脑组织（HB vs SB）共有6 437条差异表达基因，其中上调基因3 250条、下调基因3 187条。肝脏组织（HL vs SL）共有7 380条差异表达基因，其中上调基因4 018条、下调基因3 362条。肌肉组织（HM vs SM）共有6 417条差异表达基因，其中上调基因2 950条、下调基因3 467条。

图1 GO功能分类

表2 杂交子一代和褐点石斑鱼的KEGG通路分析（前20）

图2 褐点石斑鱼和杂交F1之间差异表达基因统计

2.4 差异表达基因的功能富集分析

将褐点石斑鱼和杂交F1的脑、肝脏和肌肉组织的差异表达基因比对到KEGG数据库中，结果如图3所示，共有7 452条差异表达基因比对到217条通路中。Rich Factor 指差异表达的基因中位于该 pathway 条目的基因数目与所有基因中位于该 pathway 条目的基因总数的比值，Rich Factor越大，表示富集的程度越高。-Value是多重假设检验校正之后的-value，取值范围为0到1，越接近于零，表示富集越显著。图3是选取-Value从小到大排序前 20 的pathway来作图的。其中，脑组织有19条显著富集通路（＜0.05），包括神经活性配体-受体相互作用、细胞粘附分子、视黄醇代谢和细胞周期和IgA生成的肠道免疫网络；肝脏组织有42条显著富集通路，包括通过细胞色素P450的异生素代谢、视黄醇代谢、亚油酸代谢、甘油酯代谢、脂肪酸降解等；肌肉中有25条显著富集通路，前5条显著富集通路为核糖体发生、RNA转运、RNA聚合酶、DNA复制和嘧啶代谢信号通路（＜0.05）

1）：HB vs SB；2）：HL vs SL；3）：HM vs SM

图3 通路富集分析

Fig. 3 pathway enrichment analysis

2.5 生长相关的差异表达基因分析

对褐点石斑鱼和杂交F1之间的差异表达基因进一步的分析结果如表3所示，杂交F1脑组织中的生长相关基因如生长激素（growth hormone，）、生长激素释放激素前体（growth hormone-releasing hormone precursor，）、促乳素（Prolactin，）、生长催乳素前体（somatolactin precursor，）、精氨酸催产素（arginine vasotocin precursor，）、磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶1β型（phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase type-1 beta，）与褐点石斑鱼相比显著上调（＜0.05）。同样，在肝脏组织中，蛋白磷酸酶1调节亚基3C（protein phosphatase 1 regulatory subunit 3C，）、肝型脂肪酸结合蛋白（liver-type fatty acid-binding protein，）、淀粉结合域蛋白1（starch-binding domain-containing protein 1，）、Mid1-互作蛋白1（Mid1-interacting （paired box protein Pax-3，）、肌酸激酶亚型（creatine kinase S-type，）、类心肌素（Myocardin-like）和生肌决定因子（）等基因表达上调。

表3 生长相关的差异表达基因

2.6 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证

实时荧光定量验证的相对表达量结果（Real time-PCR）和转录组测序的差异表达倍数结果（RNA-Seq）如图4所示。总体来看，在脑、肝脏和肌肉组织中12个基因的转录组测序结果均是上调表达，Real time-PCR的结果也表现出上调趋势，两种分析的方法得出的结果趋势一致，说明转录组测序结果的可靠性。

图4 差异表达基因的qRT-PCR验证结果和转录组测序结果的差异倍数比较

3 讨论

近年来，关于虎龙斑[5]、鞍带石斑鱼[6-7]、云纹石斑鱼[8]、点带石斑鱼[9]、赤点石斑鱼[10]、褐点石斑鱼[17]、黑带石斑鱼（）[18]等不同种类石斑鱼的转录组研究已有报道。目前的研究报道主要是针对同一物种进行研究，而基于不同石斑鱼的转录组比较研究少有报道。为了揭示褐点石斑鱼及其杂交F1生长差异的分子机制，本研究采用Illumina HiSeq 2000平台对褐点石斑鱼及其杂交F1的不同组织进行测序，完成了对褐点石斑鱼及其杂交F1的转录组测序、组装，获得了测序数据在不同数据库的功能注释信息，同时筛选了一批生长相关差异表达基因。

本研究共组装得到54 610条unigenes，GC含量为46.666 5%，平均长度为1 357 bp，N50含量为2 718 bp，说明组装得到的序列完整性较好，确保了转录组测序的准确性。将unigenes与Nr、Swissprot、KOG和KEGG数据库进行比对，有28 832（52.796 2%）条uniegenes得到注释，25 778条unigenes未得到注释，这可能是因为数据库相关鱼类的基因信息较少，石斑鱼的基因组信息尚未公布，或者未得到注释的unigenes可能是新的基因或者非编码序列[19]。

GO注释有助于了解石斑鱼的基因及其基因产物的功能。褐点石斑鱼和杂交F1在GO基因功能分类体系中共有34 061条unigenes得到功能注释，分属于生物过程，细胞元件和分子功能3个类别及53个二级功能类别。其中，参与细胞过程、结合、单一生物过程、代谢过程、催化过程和生物调节等功能类别的基因较多。KEGG代谢通路分析发现神经活性配体-受体相互作用、内吞作用、MAPK信号通路、粘着斑、钙信号通路、肌动蛋白细胞骨架的调控等有较多差异表达基因参与的信号通路。MAPK信号通路与生长基因密切相关，具有重要的研究价值。

本研究在脑组织中筛选到、生长激素释放激素（）、、、等生长相关的差异表达基因。GH/IGF-I轴是调节鱼类生长的重要内分泌轴[20]，、是参与该内分泌轴的重要基因。是一种重要的神经内分泌因子，可以刺激脑垂体前叶释放[21]，可以和肝细胞中的生长激素受体（Growth hormone receptor，）结合，发挥生长调控作用。由于和对鱼体进行正向调控作用，本研究中和在F1中表达水平均高于其亲本褐点石斑鱼，与杂交F1相较于褐点石斑鱼生长快速的性状相符。具有调节机体生长和渗透压的作用[22]，鱼类生长催乳素（）是由鱼类脑垂体分泌的生长激素/催乳素家族的成员[23]，推断与具有相似的作用。（Arginine vasotocin）是非哺乳类脊椎动物在下丘脑合成的神经垂体激素，调节鱼类的代谢、繁殖和渗透压等多种生理活动[24]。本研究中合成的前体在杂交F1中表达，推测该基因可能在其快速生长中起着重要作用。此外，F1代的肝脏组织中、、和等蛋白质和糖类代谢相关的基因都较褐点石斑鱼上调。参与蛋白质合成和糖原代谢等活动[25]，在斑马鱼中的研究表明和肝脏的发育相关[26]，而则跟机体糖原的储备相关[27]，有关马苏大麻哈鱼的研究中被证明是激活乙酰辅酶A羧化酶的重要因子[28]。、、Myocardin-like和均是肌肉发育的相关调节基因，其中，被发现和T-box基因家族的T-box Protein Tbx18基因协同调节中胚层的发育[29]，与骨骼肌分化相关[30]，Myocardin-like 是促进肌原性分化和细胞骨架组织的转录因子[31]，是骨骼肌发育所必须的调节因子[32]。这些肌肉发育相关的调节基因或转录因子在杂交F1中上调，可能参与调节了F1的快速生长。

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Differentially Expressed Genes Analysis of Hybrid Grouper and Female Tiger Grouper Based on Transcriptome Sequencing

LIN Ming-de1, CHEN Gang1, MA Qian1, WANG Zhong-liang1, ZHANG Jian-dong1, XIE Rui-tao1,2, TANG Bao-gui1, HUANG Jian-sheng1, ZHOU Hui1, SHI Gang1, PAN Chuan-hao1, ERIC Amenyogbe1，DENG Wen-xin1, 3

（1.,524088, China; 2.,.3.,524000, China）

【】Significant difference in the growth of tiger grouper （）and its hybrid grouper （♀×♂）F1 was found in grouper aquaculture. To analyze the molecular mechanisms leading to the fast-growth of the hybrid grouper, this study aimed to characterize the differentially expressed genes of that have growth characters, which may provide a theoretical basis for the crossbreeding of grouper.【】The Illumina HiSeq 2000 sequencing platform was used for RNA sequencing of different tissues（the brain, liver and muscle）of tiger grouper and hybrid grouper F1 of the same age. Differentially expressed genes were screened and functional annotation were conducted. Finally, real-time quantitative-PCR was performed to verify the transcriptome data.【】The raw data of sequencing obtained a total of 54 610 unigenes after quality control and assembly. The unigenes were searched against Nr, Swissprot, KOG and KEGG databases by BlastX program（value≤10-5）, and a total of 28 832 unigenes were annotated. The edgeR software package was used for differential expression analysis among the sample. A total of 20 234 unigenes were obtained, of which 10 218 were up-regulated and 10 016 were down-regulated. The Gene Ontology（GO）functional annotation showed that a total of 34 061 differentially expressed genes were clustered into 53 functional categories involving biological processes, molecular functions, and cellular components. The functional categories clustered most of the genes involved in cellular processes, binding, single-organism process, metabolic process, and catalytic activity, etc. Cluster of Orthologous Groups of proteins （KOG）analysis showed that 42 753 unigenes were annotated into 25 functional categories, most of which were involved in signal transduction mechanisms, general function prediction only, post-translational modifications, posttranslational modification, protein turnover, chaperones and transcription. The study further screened a number of growth-related genes,,,,and, etc. In this study, the expression levels of these differentially expressed genes in F1 were higher than those of their parents, which was consistent with the rapid growth of hybrid F1 compared to tiger grouper.【】The transcriptome sequencing and assembly of tiger grouper and its hybrid F1 were completed. Functional annotation information of sequencing data in different databases was obtained. A batch of growth-related differentially expressed genes was screened, the expression level of these genes in F1 is higher than tiger grouper, which consistent with realistic growth traits.

Tiger grouper; hybrid grouper; transcriptome; comparative analysis; growth-related gene

S917.4; Q786

A

1673-9159（2019）03-0015-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.03.003

2018-11-23

2016广东省省级科技计划项目“石斑鱼杂交新品种选育”(2016B020201009)

林明德（1992—），男，硕士研究生，研究方向为水产养殖。E-mail :475363641@qq.com

陈刚，教授，主要从事鱼类健康养殖和种子工程。E-mail: cheng@gdou.edu.cn

林明德，陈刚，马骞，等. 杂交石斑鱼和母本褐点石斑鱼转录组测序及差异表达基因分析[J]. 广东海洋大学学报，2019，39（3）：15-23.

（责任编辑：刘朏）