白藜芦醇对碘酸钠诱导后人视网膜色素上皮细胞凋亡的抑制作用△

刘文睿 戴国宇 杨妮娟 刘华

年龄相关性眼病是指随着年龄的增长由眼退行性改变所引起的一系列眼科疾病。年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是一种常见的年龄相关性眼病[1-2]，其中干性 AMD 占主要组成部分，同时也是老年人主要的致盲原因之一。干性 AMD的发生发展是多因素共同作用的结果。虽然目前干性 AMD 的发病机制尚未完全阐明，但是近年来的研究发现，视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)细胞的老化与代谢在其发病过程中扮演着重要角色[3]，RPE细胞是位于绒毛膜毛细血管/Bruch膜复合物和光感受器之间的静止单层细胞。在遗传、炎症、氧化应激等方面，对RPE细胞的研究取得了不少进展。近期我们团队发现RPE细胞的凋亡致使其他正常细胞生理功能缺失，可能导致AMD视网膜形成玻璃膜疣沉积，大块的玻璃膜疣和增大的玻璃膜疣面积将增加形成AMD的风险[4]。

白藜芦醇(resveratrol，RES)是一种天然多酚类化合物，是肿瘤的预防剂，也对降低血小板聚集、预防和治疗动脉粥样硬化以及治疗心脑血管疾病有一定的作用。RES主要来源于葡萄、虎杖等植物。目前有研究发现，RES可通过调节多个细胞信号转导通路发挥抗凋亡作用，近年来已成为抗衰老领域的研究热点。本课题以人类RPE为研究对象，以碘酸钠(NaIO3)诱导的RPE细胞模拟干性AMD，探究RES对RPE-19细胞凋亡的影响及其作用机制，为其用于干性AMD的治疗提供新的靶点[5]，希望能发掘出RES在干性AMD治疗中的潜力，为眼科研究作出贡献。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 细胞株为购于美国ATCC公司的人类RPE-19细胞。细胞在含体积分数10%胎牛血清、含100 mg·L-1青霉素和链霉素的DMEM/F-12培养基中培养，并置于37 ℃、含体积分数5%CO2的恒温恒湿培养箱中培养，适时更换培养基并及时传代。实验细胞分为空白对照组(Control组)、碘酸钠损伤组(NaIO3组)以及加入RES的碘酸钠损伤组(RES+NaIO3组)。

1.1.2 试剂与仪器 DMEM/F-12细胞培养基、抗菌素、含2.5 g·L-1EDTA的胰蛋白酶(美国 Hyclone公司)；胎牛血清(德国Serapro公司)；兔来源一抗Bcl-2和Bax抗体(英国Abcam公司)；山羊抗兔二抗 (美国CST公司)；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO；中国索莱宝生物公司)；ECL化学发光液、Hosste33342试剂盒(中国碧云天生物公司)；RES干粉(中国奥特斯生物公司)。荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)；流式细胞仪、培养箱(美国Thermo公司)；超高速离心机(美国Sigma公司)；酶标仪、蛋白电泳仪(美国BIO-RAD公司)；凝胶成像仪(美国GE公司)；生物安全柜(美国Nuner公司)。

1.2 方法

1.2.1 药品制备 取一定量的RES干粉溶于DMSO中制备浓度为10 mol·L-1RES原液，置4 ℃冰箱备用，实验时需用DMEM/F-12培养基二次稀释成相应浓度。取NaIO3粉末溶解于磷酸盐缓冲液(PBS)中制备50 g·L-1的母液常温保存，实验时需用DMEM/F-12培养基稀释成相应浓度。

1.2.2 MTT检测 MTT检测药物最佳浓度。取对数生长期的RPE细胞稀释成浓度为10×103mL-1并接种于96孔板中培养24 h。此时细胞完全贴壁并处于对数生长期，更换无血清培养基，添加各不同浓度的RES溶液20 μL培养24 h，浓度分别为0、5、10、25、50、75、100、150、200 μmol·L-1。24 h后每孔加入20 μL MTT溶液，置于37 ℃、含体积分数为5%CO2培养箱孵育4 h后弃MTT溶液；每孔加入15 μL DMSO，水平摇动10 min，用酶标仪在490 nm波长下检测各组吸光度(A)值。

MTT检测细胞生存率。取最佳RES生长浓度按相同操作步骤在96孔板培养12 h，分别加入稀释浓度为0、100、300、600、900、1200、1500、1800、2100、2400 μmol·L-1的NaIO3溶液中继续孵育12 h，测各组吸光度(A)值。光学显微镜下观察1800 μmol·L-1NaIO3浓度下各组细胞生长状态。

1.2.3 Western blot检测 Control组细胞在完全培养基中培养24 h后换为无血清培养基培养24 h。RES+NaIO3组在完全培养基中培养24 h后加入含有RES和NaIO3的无血清培养基培养24 h。NaIO3组在完全培养基中培养24 h后加入含有NaIO3的无血清培养基培养24 h。取培养48 h的各组RPE-19细胞加入RIPA裂解液冰上裂解，收集细胞悬液超声裂解3次，每次10 s，间隔5 min。静置30 min后4 ℃12 000 r·min-1离心30 min，取上清液BCA法定量后制备样品备用。取一定量样品在SDS-PAGE凝胶中恒压110 V电泳90 min，恒流300 mA转膜90 min。BSA常温封闭2 h，TBST洗膜3次，每次5 min；Bax和Bcl-2的一抗稀释液4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5 min；加入对应二抗室温孵育2 h后滴加ECL显影并拍照。实验结果使用Image J进行半定量分析。

1.2.4 Hosset33342检测 在24孔板中培养各组细胞48 h后弃培养液，PBS洗1 min，40 g·L-1多聚甲醛4 ℃固定30 min；弃固定液后PBS漂洗3次，每次5 min；24孔板中滴加Hoechst 33342工作液室温避光染色15 min；PBS漂洗3次，每次5 min；滴加适量体积分数10%甘油溶液，荧光显微镜下观察。

1.2.5 流式细胞术(Annexin V-FITC/PI 双染色法)检测各组细胞凋亡情况 各实验组按照1.2.3培养方法培养48 h后收集对数生长期的RPE细胞，PBS漂洗3次，每次1 min；加入5 μL Annexin V-FITC和1 μL PI混匀，避光孵育10 min，PBS洗涤 1 min；每组细胞中加入40 μL PBS于流式细胞仪上检测细胞凋亡情况，观察并记录。

2 结果

2.1 光学显微镜下细胞形态和分布 光学显微镜下各组细胞形态和分布(图1)：Control组细胞致密、均匀，形态规整，呈梭形，增殖能力强；RES+NaIO3组细胞形态良好、长势均匀、细胞略有形变、生长速度尚可、细胞间偶见细胞碎片；NaIO3组有大量细胞死亡，细胞量少，形态欠佳、分布呈团簇状，细胞透光度增加。

图1 光学显微镜下检测培养24 h后的RPE细胞状态。A：Control组；B：RES+NaIO3组；C：NaIO3组。比例尺：100 μm

2.2 MTT检测最佳药物浓度 MTT检测结果经单因素方差分析发现，在RES浓度为5 μmol·L-1时细胞生存率最高，且与其他浓度下细胞生存率差异均有统计学意义(均为P<0.05，见图2)，此时药物对细胞无不良影响、没有明显的细胞毒性，可以排除药物的不良干扰因素。通过RES对各组细胞不同程度损伤的保护效果分析发现，无论是轻度损伤还是重度损伤，RES对PRE细胞皆有很强的保护作用，且对中度损伤效果最佳。RES+NaIO3组细胞生存率均明显优于NaIO3各浓度组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

2.3 Western blot检测结果 Western blot法检测各组相关蛋白的表达情况，结果见图3。NaIO3组较Control组凋亡蛋白Bax的表达量显著上升(P<0.05)，Bcl-2的表达量显著下降(P<0.05)，细胞损伤严重。RES+NaIO3组相关蛋白表达量与Control组差异无统计学意义(P>0.05)，与NaIO3组有明显差别，其中RES+NaIO3组Bax蛋白的表达量明显低于NaIO3组，Bcl-2蛋白的表达量较NaIO3组明显下降。且两组蛋白之间表达差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

图2 RES浓度为5 μmol·L-1时，各NaIO3组RPE细胞的生存率

图3 Western blot法检测各组Bax(A)和Bcl-2蛋白(B)的表达量以及各组灰度值的比较。*P<0.05，**P>0.05

2.4 Hosset33342检测结果 该染料为DNA的特异性荧光探针，细胞核呈亮蓝色荧光。凋亡细胞呈高亮圆点，正常细胞则呈蓝色圆点状(图4)。Control组细胞中几乎不含有高亮圆点，为(2.33±1.53)个，而NaIO3组中含有大量高亮圆点状的凋亡细胞，为(82.00±14.11)个，且细胞含量明显低于Control组(P<0.05)，RES+NaIO3组中凋亡细胞较为分散，数量较少，为(39.33±8.02)个，凋亡细胞量与NaIO3组差异有统计学意义(P<0.05)。

图4 荧光显微镜检测培养48 h后各组细胞Hosset33342染色。A：Control组；B：RES+NaIO3组；C：NaIO3组。(A1、B1、C1)比例尺：100 μm；(A2、B2、C2)比例尺：50 μm

2.5 流式细胞术检测结果 流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况发现，Control组RPE细胞存在极少凋亡；但NaIO3组细胞中含有大量的凋亡细胞，其中晚期凋亡占主要部分；RES+NaIO3组中含有少量的凋亡细胞，凋亡细胞以早期凋亡为主，但也存在一定的晚期凋亡。各组间差异均有统计学意义(均为P<0.05，见图5)。

图5 流式细胞术检测各组RPE细胞培养48 h后的凋亡情况。A：Control组；B：RES+NaIO3组；C：NaIO3组

3 讨论

随着中国逐步进入老龄化社会，AMD的患病率也在逐年上升，AMD导致的视力下降、视物模糊等问题越来越受到重视[5-6]。虽然AMD已成为眼科学研究的热点之一，国内外对AMD也进行了大量的实验研究，但是目前其发病机制仍未完全清楚，临床上也未找到理想的治疗方法，因此社会迫切需求更加先进的治疗手段以及具有更好治疗效果的药物。经过多年的不断探索，我们团队采用一种较为成熟的体外实验方案来最大程度模拟AMD，以NaIO3损伤的RPE细胞模拟AMD[7]，采用不同浓度的RES作用后发现，在已测得的任意浓度下RES都对损伤的RPE细胞有尚佳的保护效果，并能有效对抗细胞凋亡，最佳浓度下进行的实验也表明，RES对损伤的RPE细胞有很好的保护作用。

RPE细胞没有神经传导功能，也无法感光，但是它对维持感光细胞的正常生理功能具有重大的意义[1]。随着年龄的增长，RPE细胞体内会不断地集聚脂褐素，脂褐素吸光后与氧反应产生过氧化氢、超氧负离子等化学物质，使脂质过氧化，RPE细胞受到破坏，而在这种病理条件下的RPE细胞会加速积聚脂褐素的过程继而产生恶性循环[7-8]。长期氧化应激导致的 RPE 细胞结构与功能异常是引发 AMD 的重要原因[2，9]。本研究发现，NaIO3组细胞虽明显减少，但细胞中却含有大量的色素沉积。目前的研究虽没有证实色素沉积理论与细胞损伤有无直接的关系，但是这种观点无疑为研究AMD发生和发展提供重要的数据支持。

RES有很强大的抗氧化功能和抗自由基形成的功能，这可能是起保护细胞结构和功能不被破坏，阻止细胞进一步损伤的重要途径[10]。RES具有抗炎、抗氧化、抗血小板凝聚、抗动脉硬化以及抗癌等多种功效且作用效果明显。本研究发现，RES对损伤的RPE细胞在抵抗凋亡方面也发挥着重要的作用。Bcl-2多分布于增殖分裂期的细胞，而Bax则多分布于生长静止、凋亡的细胞中，且二者的含量可以反映细胞的凋亡状况[11]。通过对Bcl-2和Bax蛋白进行凝胶电泳实验我们发现，RES抗凋亡作用明显。有研究者认为，RES可以作为Sirt1的激动剂，影响生物热效能，可模拟热量限制来抑制凋亡，从而起到延长细胞寿命的作用[12]。RES也可能抑制某种物质进入细胞后引起的钙离子浓度增加，从而稳定线粒体的膜电位、抑制线粒体细胞素C的释放和Caspase的活化，上调Sirt1和Ku70、下调Bax蛋白表达而抑制RPE细胞凋亡[13]。

Lhee等[14]证实，RES在癌细胞和非癌细胞中通过截然不同的两种途径作用于生物体，但其共同作用靶点都是Sirt1，在正常细胞中可以抑制p53的特异性结合位点发生乙酰化，从而抑制p53介导的细胞凋亡，维持有丝分裂正常进行。此外，Sirt1可以作用于Bax结合的DNA修复因子Ku70,使之不被转移到线粒体，从而达到抑制线粒体介导的细胞凋亡作用。同时,RES也可作用于转录因子FOXO调控基因沉默、影响寿命和机体代谢。在肿瘤细胞中Sirt1的负性调控因子DBC1被激活增强了p53信号通路的活性，从而诱导细胞凋亡[15-17]。RES也可作用于MAPK和NF-kB途径调节的信号转导来促使癌细胞的自溶[18]。RES的作用途径和作用原理目前还没达成共识，但研究者普遍认为RES的作用是多通路、多基因的激活和抑制导致的。

本研究通过观察RES对NaIO3诱导损伤的细胞的作用，初步探讨了RES在抵抗RPE细胞凋亡方面的作用。希望能以此为契机深入研究在治疗AMD方面的作用，并深度发掘RES在治疗AMD中的作用途径和具体通路，也希望RES能成为治疗其他眼病的一种新的缓解和治疗途径，为临床医学提供基础依据。