miR-26b对口腔鳞癌细胞SCC15肿瘤干性的抑制作用

钟文德 嘉红云 陈广盛

广州医科大学附属第二医院（广州510260）

口腔癌是头颈肿瘤的主要类型，其中大部分为口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）［1］。尽管近年对OSCC的早期诊断和治疗有明显提高，但患者5年生存率仍不足50%［2］。肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）的存在是肿瘤复发的关键，而上皮间充质转化（epithelial to mesenchyrnal transition，EMT）的发生是癌细胞获得干细胞样表型的重要途径，miRNAs 与癌细胞干性的获得密切相关［3］。FAN等［4］指出过表达miR-26b可促进结肠直肠癌细胞系的EMT和干细胞样表型获得而增加肿瘤致病性，有趣的是FUKUMOTO［5］研究却发现miR-26b 对OSCC 具有抑癌作用。但miR-26b 对口腔癌细胞肿瘤干性的影响到底如何尚无报道。本研究希望通过探讨miR-26b 对人口腔鳞癌细胞SCC15 干性的影响，为上述问题提供实验依据，同时为OSCC 治疗靶点的寻找提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂胎牛血清和DMEM 培养基购自美国Gibco 公司，miRNA 分离试剂购自美国Ambion公司，miRNA-26b 特异性引物和探针、TaqMan miRNA 反转录试剂盒和TaqMan miRNA 检测试剂盒均购自美国Applied Biosystems 公司。TRIzol 溶液、Lipofectamine 2000 购自美国Invitrogen 公司。miR-26b 模拟物、miR-26b 抑制物、阴性对照、miR-26b 特异性PCR 引物购自广州锐博生物。β-actin 及E-钙粘蛋白抗体购自Cell Signal 公司。

1.2 研究对象5例口腔鳞癌患者均来自2015年至2017年到我院就诊病人，男4例，女1例，年龄48～72岁。纳入标准：患者病灶位置的病理标本均已确诊。其中伴淋巴转移者2例，未转移者3例；病灶位置分类：舌癌4例，牙龈癌1例；WHO 病理分级：高分化4例，低分化1例；取患者各自癌旁正常口腔组织作为对照组。人口腔鳞状癌细胞SCC15 常规复苏，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 细胞转染接种SCC15 细胞于6 孔板中；以Lipofectamine 2000 为转染试剂分别用阴性对照、miR-26b 模拟物和miR-26b 抑制物对细胞进行转染，并据此把细胞分为NC 组、过表达组、抑制组。8 h 后培养液更换为含10%胎牛血清的DMEM 培养基，继续培养24 h 行后续实验。

1.4 RNA 提取和real-time PCR按试剂盒操作说明提取SCC15 细胞、目标患者口腔癌组织及癌旁正常组织的总RNA，Real-time PCR 检测样本miR-26b 表达水平。癌组织miR-26b 表达以癌旁正常组织miR-26b 为对照，结果用2-（Ct 肝癌细胞—Ct 癌旁正常组织）方式表示。SCC15 细胞以U6为内参，结果用2-［过表达组/抑制组Ct（miR-26b-U6）- 对照组Ct（miR-26b-U6）］表示以观察细胞转染效果；继而以GAPDH 为内参，检测Nanog 及OCT4（表1）的表达，结果以2-△△Ct表示。

表1 Real-time PCR 检测引物Tab.1 Real-time PCR detection primers

1.5 体外成球实验无血清培养基内添加2%B27、20 ng/mL 表皮生长因子、20 ng/mL 成纤维细胞生长因子、1%的甲基纤维素，调节细胞培养液pH约6.8左右。以约2 000个/孔接种SCC15细胞于6孔板，7 d后计算细胞球形成效率（直径＞75 μm的细胞球个数/2 000）。

1.6 免疫印迹法以β-actin 为内参，检测E-钙粘蛋白水平，ImageJ 1.35V 软件进行分析，结果以E-钙粘蛋白密度/β-actin 密度表示。

1.7 统计学方法SPSS 16.0 行统计学分析，以均数±标准差表示。组间比较用双侧t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-26b 表达在口腔癌组织中下调见图1。5例口腔癌患者癌组织中miR-26b的表达量均＜1，表明患者口腔癌组织miR-26b 表达均低于癌旁正常组织。

2.2 细胞转染结果过表达组SCC15 细胞的miR-26b 表达量为（22.22±2.70），显著高于NC 组（P＜0.05），抑制组的表达量为（0.34±0.07），显著低于NC 组（P＜0.05）。结果显示本次细胞转染效果良好。

2.3 miR-26b 对SCC15 细胞体外成球能力的影响体外成球实验100 倍镜下观察结果见图2，过表达组的细胞成球率明显低于NC 组（P＜0.05），抑制组的成球率则高于NC 组（P＜0.05）。

图1 miR-26b 在口腔癌患者癌组织中的表达Fig.1 The expression of miR-26b in oral cancer patients′cancerous tissue

2.4 miR-26b 对SCC15 细胞干性基因表达的影响见图3。过表达组Nanog 及OCT4 基因表达量明显低于NC 组（P＜0.05），抑制组2个干性基因表达量则高于NC 组（P＜0.05）。

2.5 miR-26b 对SCC15 细胞E-钙粘蛋白水平的影响见图4。抑制组SCC15 细胞E-钙粘蛋白水平低于NC 组（P＜0.05），过表达组E-钙粘蛋白水平高于NC 组（P＜0.05）。

图2 miR-26b 对SCC15 细胞体外成球能力的影响Fig2 The effect of miR-26b on SCC15 cells in Sphere experiment

图3 miR-26b 对SCC15 细胞干性基因表达的影响Fig3 The effects of miR-26b on stemness gene expression of SCC15 cells

图4 miR-26b 对SCC15 细胞E-钙粘蛋白的影响Fig4 The effect of miR-26b on E-cadherin of SCC15 cells

3 讨论

OSCC 占口腔肿瘤的95%及头颈部鳞状细胞癌的40%，发展中国家OSCC 高居男性常见肿瘤的第六位及女性的第十位［2］。虽然目前包括手术、放疗、化疗等治疗手段有了长足发展，但其高复发率和转移率使OSCC 患者的5年存活率仍然偏低［6］。miRNAs 参与调节OSCC的发病及预后［7］，FUKUMOTO等［5］构建了一个针对OSCC的miRNA矩阵对差异表达的miRNAs 进行研究，发现miR-26b缺失可通过调控跨膜基因TMEM184B 而增强OSCC 癌细胞的致病力。BAGHAEI等［8］则通过细胞实验验证了过表达miR-26b 能抑制口腔鳞癌细胞的迁移、侵袭及增殖。虽然有研究［4］显示miR-26b可促进结直肠癌的转移，但LI等［9］实验结果却显示miR-26b 能明显抑制同样属于消化道肿瘤的食道癌细胞的增值，提示miR-26b 可能是一个多能基因，在各种肿瘤中表现出不同功能。而对于OSCC，本研究发现5例口腔癌患者的癌组织中miR-26b的表达显著低于相邻的正常组织，结合FUKUMOTO等［5］和BAGHAEI等［8］的研究，miR-26b 对OSCC 是一个抑癌基因。

CSCs 是肿瘤组织或者转移灶中存在的一群具有自我更新能力的细胞，具有成体干细胞的功能特征，这种能力被称之为肿瘤细胞的“干性”，与肿瘤的复发密切正相关性，也是OSCC 恶化的主要驱动力之一［10］。miRNAs 可调控肿瘤干性的获得［11］，TROMPETER等［12］发现miR-26b 能加速脐带血成体干细胞的分化，LIN等［13］也发现miR-26b 可下调上皮卵巢癌细胞干性基因OCT4 表达并抑制其迁移，显示miR-26b 对部分癌细胞的干性具有抑制作用，但目前未见miR-26b 影响OSCC 干性的报道，因此本研究以经典的OSCC 细胞模型SCC15 为对象，进行了初步的探讨。成球能力是单个癌细胞自我更新能力的重要表现，Sphere 实验是通过观察癌细胞的成球能力从而评估肿瘤细胞干性的重要体外实验方法［14］，Nanog和OCT4 作为维持干细胞自我更新和多能性的关键因子，能使终端分化细胞重新进入细胞周期而进行增殖活动，是肿瘤细胞干性获得的重要分子标志物［15］。本次实验显示SCC15 细胞在过表达miR-26b 后成球能力下降，抑制miR-26b 后成球能力增加；同时miR-26b 能抑制SCC15 细胞Nanog和OCT4 两个干性基因的表达，表明miR-26b 对SCC15 细胞的肿瘤干性有负调节作用，与本研究的预期相符。

EMT 能上调血管生成前因子VEGF-A的表达诱导肿瘤血管生成的增加，从而增加肿瘤细胞移植到免疫缺陷小鼠体内时启动和增殖肿瘤的能力，这是CSCs 丰富的一个主要特征，提示EMT的发生与肿瘤细胞干性获得密切相关［16］。E-钙粘蛋白主要分布在上皮细胞，具有抑制转移的作用，OSCC 中E-钙粘蛋白表达的下降是其EMT 过度发生的重要标志［17］且与其疾病预后相关［18］。本次Western Blot 结果显示miR-26b 能正向调节SCC15细胞的E-钙粘蛋白表达，因此笔者推测miR-26b可能通过提高OSCC 细胞E-钙粘蛋白水平而抑制其EMT的发生，从而延缓口腔癌细胞对肿瘤干性的获得。本研究结论仅在体外针对一种OSCC 细胞得到体现，下一步将以修饰miR-26b 表达的OSCC 细胞对裸鼠行定植实验，希望通过体内实验的验证，继续完善本研究结论。

综上所述，本研究提示miR-26b 具有抑制口腔癌细胞SCC15 肿瘤干性的作用，为miR-26b 对OSCC的抑制作用提供了一定的理据，miR-26b 具有成为OSCC 治疗靶点的潜力，为OSCC的根治提供了新的思考方向。