脂联素水平及位点的基因多态性与广东地区2 型糖尿病的相关性

王卓 周强 唐希才 区焕桃

1广州市中医医院检验科（广州510130）；2广州医科大学附属第二医院检验科（广州510260）；3广州医科大学附属第三医院检验科（广州510150）；4广州医科大学附属第五医院检验科（广州510700）

近年来，由于人民生活水平的提高、社会人口老龄化、生活方式改变等因素，糖尿病患病率逐年增加。脂联素由脂肪细胞分泌，由Scherer 在小鼠的3T3-L1 脂肪细胞中首次发现，是一种具有内源性生物活性的多肽或者蛋白质，其水平与心脑血管疾病、糖尿病、自身免疫病、骨质疏松、慢性阻塞性肺疾病、泌尿系统疾病等多个系统疾病相关［1-3］。其中，脂联素水平和2 型糖尿病关系最为密切，也是国内外学者研究最多的领域之一。脂联素与其受体AdipoRl、AdipoR2 相结合，介导AMPK、MAPK和PPARa 通路活化，促进机体糖代谢和蛋白质合成、促进脂肪酸氧化，增加胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗，从而产生控制血糖和影响脂质代谢作用［4］。研究［5-7］发现，血浆脂联素水平的降低是发生胰岛素抵抗和2 型糖尿病（T2DM）的独立危险因素。国内外许多学者对脂联素不同基因型与T2DM的相关性进行了研究。其中，有学者［8-10］发现脂联素rs1063539和rs3821799 单核苷酸多态性（SNPs）与血清中的脂联素水平明显相关。随着遗传学和分子生物学的发展，许多新的技术逐步应用到2 型糖尿病研究中，从基因水平探究2 型糖尿病的发病原因及病理生理过程，为糖尿病的研究提供了有力的证据。近年来，脂联素的作用在2 型糖尿病的研究中已成为热点，但在目前的脂联素与2 型糖尿病的关系研究中，广州地区仅本课题组有单核苷酸多态性与2 型糖尿病的相关报道。本文通过检测2 型糖尿病人的脂联素水平，探讨脂联素与胰岛素抵抗和2 型糖尿病的相关关系，并通过研究广东地区2 型糖尿病人群脂联素rs1063539和rs3821799 基因型的分布情况，探讨其与2 型糖尿病的相关性。分析这两个脂联素基因是否是2 型糖尿病的易感基因，为2 型糖尿病的早期预测、诊断、治疗及预后提供分子生物学方面的依据。

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 正常对照组收集广州医科大学附属第二医院体检患者标本192例为对照组，其中男85例，女107例，无2 型糖尿病，空腹血糖均＜5.6 mmol/L，餐后2 h 血糖值正常且均排除其他代谢性疾病，无冠心病史，且心电图正常。

1.1.2 2 型糖尿病组收集2014年1月至2015年12月广州医科大学附属第二医院新发2型糖尿病患者180例作为病例组，其中男81例，女99例，均符合1999年WHO 制定的糖尿病诊断标准，即空腹血糖≥7.0 mmol/L 或餐后2 h 血糖≥11.1 mmol/L［4］，未使用过胰岛素，噻唑烷二酮类以及其它口服降糖药，同时排除1型糖尿病和其它相关代谢性疾病。

1.2 仪器及试剂

1.2.1 实验仪器全自动生化分析仪（罗氏C8000），NanoDrop-1000 全波长紫外光/可见光扫描分光光度计（美国NanoDrop 公司），质谱检测仪（MassARRAY Analyzer Compact），点样仪（MassARRAY Samsung Nanodispenser），384 孔双头PCR 仪（Gene-Amp®PCR System 9700 Dual 384-Well Sample Block Module）。

1.2.2 实验试剂脂联素ELISA 试剂盒（BIO TSZ Trust Specialty Zeal）、胆固醇酯酶试剂盒、甘油三酯试剂盒和胆固醇酯酶氧化酶试剂盒（罗氏原装配套试剂）；iPLEX 延伸相关试剂、SpectroCHIP 生物芯片、HOTSTARTtaq 酶、SAP 酶、纯化琼脂由美国Sequenom 公司提供。

1.3 实验方法

1.3.1 脂联素SNP 位点的选择依照NCBI 数据库查阅出脂联素SNP 基因的种类，汇总国内外脂联素SNP的相关资料及文献，选取rs1063539和rs382179 两个位点对其与广东地区2 型糖尿病相关性进行研究。

1.3.2 标本采集受检人群需隔夜严格空腹8 h以上，采10 μL 静脉血，分别为EDTA-K2 抗凝血两支各2 μL，充分摇匀以抗凝，用以检测脂联素单核苷酸多态性；干燥管两支各3 μL，3 000 r/min 离心15 min。其中一支分离血清并冻存于-20 ℃冰箱，用以检测血清脂联素；另一支做生化指标的检测，包括空腹葡萄糖（fasting blood glucose，FBG）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDLC）、低密度脂蛋白（LDL-C）。

1.3.3 生化指标的测定胆固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）测定采用酶比色法，高密度脂蛋白胆固醇（HDL）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL）的测定采用均相酶比色法。

1.3.4 脂联素的检测采用酶联免疫吸附试验（双抗体夹心法）。严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.5 脂联素rs1063539和rs3821799 位点基因型的检测引物由上海英俊生物技术有限公司合成。（1）rs1063539：上游引物序列：Sequence（5′-3′）：ACGTTGGATGGGCAGGGTTATTCCTTTGTG 下游引物序列：Sequence（5′-3′）：ACGTTGGATGTTCTC TCAGGCCTCTTTTGG 单碱基延伸引物序列：Sequence（5′-3′）：CCATCCTCTTTTGGCCTCAGTTGA CT。（2）rs3821799：上游引物序列：Sequence（5′-3′）：ACGTTGGATGTCTCTATGCTCCATACTTTG 下游引物序列：Sequence（5′-3′）：ACGTTGGATGAA TGTGCAAGGCTCTGTTGG 单碱基延伸引物序列：Sequence（5′-3′）：GAGTTGCAAGGCTCTGTTGGTGGTTAC。（3）使用Sequenom MassArray 系统基因分型系统进行SNP 分型，主要步骤为：PCR 扩增反应、SAP 反应、延伸反应、去盐，导入Assay 系统，使用点样仪点样，使用质谱仪进行Mass ARRAY 分析，最后输出实验报告。

1.4 统计学方法测定数据采用（）表示。使用SPSS 13.0 处理分析实验数据。采用t检验对正常对照组与2 型糖尿病组的空腹血糖、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血清脂联素水平进行检验，并做Pearson 相关分析。基因型群体符合程度用Hardy-Weinberg 遗传平衡定律检验，计数资料基因型频率在2 型糖尿病病例组与对照组间的差异比较采用行×列表资料的双侧检验。基因型与疾病相关性分析通过Logistic 回归分析，用比值比（OR）和95%可信度区间（CI）表示相对危险度。总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等生化指标在检验各组变量的正态分布后，在2 型糖尿病病例组与对照组间的差异及在各基因型间的差异比较采用独立样本t检验。所有统计资料均以双侧概率检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清脂联素与各项生化指标临床指标比较2型糖尿病组的血清脂联素水平为（497±104）pg/mL，明显低于对照组（1 056±300）pg/mL，差异有统计学意义（P=0.001），比较两组的甘油三酯和高密度脂蛋白，差异皆有统计学意义（P＜0.05）。而总胆固醇和低密度脂蛋白的比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 对照组及2 型糖尿病组血清脂联素与各项生化指标比较Tab.1 Comparison of serum adiponectin and biochemical indexes in control group and T2DM group ±s

表1 对照组及2 型糖尿病组血清脂联素与各项生化指标比较Tab.1 Comparison of serum adiponectin and biochemical indexes in control group and T2DM group ±s

注：2 型糖尿病组的血清脂联素水平明显低于对照组，**P＜0.01；2 型糖尿病组的甘油三酯高于对照组，而高密度脂蛋白低于对照组，*P＜0.05

组别脂联素(pg/mL)TG（mmol/L）CHOL（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）对照组1056±300 1.13±0.52 4.74±0.72 1.42±0.44 3.12±1.87 2 型糖尿病组497±104 1.89±0.71 4.59±1.30 1.07±0.38 2.75±0.92 P 值0.001**0.010*0.214 0.030*0.190

2.2 Pearson 线性相关性分析相关性分析显示，对照组血清脂联素与甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白以及高密度脂蛋白均无明显相关（r值分别为0.124、0.118、-0.028和0.031，均P＞0.05）；2 型糖尿病组血清脂联素与甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白以有高密度脂蛋白亦无明显相关（r值分别为-0.053、-0.013、0.048和-0.002，均P＞0.05）。见表2。

2.3 基因型分布频率rs1063539和rs3821799 位点基因型频率两位点基因型频率均已达到遗传平衡，具有群体代表性。rs1063539 基因型的分布频率差异有统计学意义（P＜0.05）；rs3821799 基因型的分布频率差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表2 对照组与2 型糖尿病组血清脂联素与生化指标的Pearson 线性相关性分析Tab.2 Pearson linear correlation analysis of serum adiponectin and biochemical indexes between control group and T2DM group

表3 rs1063539（C/G）、rs3821799（C/T）基因型频率比较Tab.3 Comparison of genotype frequencies of rs1063539（C/G）and rs3821799（C/T）

2.4 Logistic 回归分析rs1063539 基因型GC 是GG 患病率的1.724 倍，OR=1.724，95%CI：1.124～2.645（P＜0.05）；CC + GC 是GG 患病率的1.292倍，OR=1.292，95%CI：1.052～1.587（P＜0.05）；rs3821799 基因型间危险度差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

2.5 病例组rs1063539和rs3821799 位点基因型对应生化指标分析统计采用单因数方差分析及两两比较，病例组rs1063539 基因型CC 分别与CG、GG 对应的TG 比较，P值分别为0.04、0.01，其余各基因型对应的生化指标经两两比较，其差异均无统计学意义（P＞0.05）；病例组rs3821799 位点基因型对应的生化指标经两两比较，其差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

3 讨论

3.1 脂联素与2 型糖尿病及胰岛素抵抗脂联素大量存在于血液循环中，作为脂肪细胞因子中唯一的负性调节激素倍受瞩目。研究［11］表明，脂联素具有增强胰岛素敏感性、促进肌肉及脂肪组织吸收葡萄糖，增强糖异生，抑制肝糖原合成等效应，其水平降低预示着胰岛素抵抗及糖尿病的发生。在2 型糖尿病相关性因素研究中，王楚瑗等［12］发现2 型糖尿病人群的脂联素含量均低于健康人群，低血浆脂联素血症是发生胰岛素抵抗和T2DM的独立危险因素。

表4 rs1063539（C/G）和rs3821799（C/T）基因型与2 型糖尿病的危险度分析Tab.4 Risk analysis of rs1063539（C/G）and rs3821799（C/T）and T2DM

表5 病例组rs1063539（C/G）、rs3821799（C/T）基因型对应生化指标的关系Tab.5 Relationship between rs1063539（C/G）and rs3821799（C/T）genotypes in case group ±s

表5 病例组rs1063539（C/G）、rs3821799（C/T）基因型对应生化指标的关系Tab.5 Relationship between rs1063539（C/G）and rs3821799（C/T）genotypes in case group ±s

位点rs1063539 rs3821799生化指标（mmol/L）TG CHOL HDL-CH LDL-CH TG CHOL HDL-CH LDL-CH基因型CC（n=29）1.55±0.78 4.57±0.96 1.07±0.38 2.83±0.89 CC（n=65）1.32±0.75 4.60±0.95 1.22±0.43 2.89±0.74 CG（n=161）1.29±0.68 4.60±0.83 1.27±0.41 2.88±0.70 CT（n=177）1.25±0.62 4.57±0.89 1.25±0.37 2.85±0.75 GG（n=182）1.19±0.59 4.51±0.90 1.28±0.36 2.80±0.73 TT（n=121）1.23±0.58 4.52±0.84 1.26±0.37 2.88±0.75

本研究也证实，2 型糖尿病组脂联素水平明显低于对照组，差异有统计学意义（P=0.001），与既往国内外文献［13-16］报道一致。研究表明，脂联素改善胰岛素抵抗、2 型糖尿病的作用机制主要有以下几个方面：（1）通过降低组织中甘油三酯浓度以增强胰岛素信号传导通路的敏感性；（2）通过活化过氧化物酶增殖因子激活受体a（PPAR-a）途径，促进脂肪酸氧化，抑制肝脏输出葡萄糖，从而降低脂肪酸、甘油三酯、葡萄糖水平［17-18］；（3）脂联素通过活化AMP 激活的蛋白激酶（AMPK）途径，在体内外直接调节糖代谢和胰岛素的敏感性，刺激葡萄糖的利用，增加脂肪酸氧化，提高胰岛素敏感增强胰岛素控制血糖的能力，从而降低血糖水平［12］。由此，脂联素可通过PPAR和AMPK 介导通路，调节肝脏、骨骼肌及脂肪细胞的糖代谢，增加机体的胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗［19］。

本研究还发现，对照组和2 型糖尿病组的甘油三酯和高密度脂蛋白水平的比较差异皆有统计学意义（P＜0.05），而两组总胆固醇和低密度脂蛋白水平的比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。对照组甘油三酯浓度为（1.13±0.52）mmol/L，明显低于2 型糖尿病组的（1.89±0.71）mmol/L，与大部分文献相吻合。有研究［15］显示，具有2 型糖尿病等代谢性疾病发病高风险的患者，早在其出现动脉粥样硬化的病变之前，血清中脂联素的水平已经开始下降，并且随着病情的发展，脂联素水平可呈进行性下降的趋势。脂联素在血液循环中，可以促进肌肉和肝脏里游离脂肪酸的摄取和代谢，进而可降低血液中游离脂肪酸和甘油三酯的浓度。可见脂联素水平的升高可以阻止血清中甘油三酯的浓度升高，同时还能增强胰岛素抑制肝糖异生。对照组高密度脂蛋白浓度为（1.42±0.44）mmol/L，高于2 型糖尿病组的（1.07±0.38）mmol/lL，差异有统计学意义。众所周知，高密度脂蛋白是一种独特的抗动脉粥样硬化的血浆脂蛋白，是冠心病的保护因子，它可以将血管壁内的胆固醇转运到肝脏进行进行分解清除。据国内外最新研究成果［20-21］可发现，高密度脂蛋白胆固醇可以抑制胰岛β细胞的凋亡，增加胰岛β细胞的分泌功能、并且可以提高肌肉摄取葡萄糖的能力，以及改善胰岛素抵抗，降低血糖水平，延缓或阻止糖尿病的发生发展。已有临床研究指出，低血清高密度脂蛋白胆固醇水平可作为预测新发2 型糖尿病的一个独立危险因素［22］。

此外，大量研究也表明，肥胖、动脉粥样硬化，冠心病等疾病发生时，患者的血清脂联素水平下降。也有学者发现，在2 型糖尿病肾病阶段，血清脂联素水平上升明显，其水平升高可能与肾功能减退有关，血清脂联素升高可能在患者的内皮功能损害过程中发挥了作用。

3.2 脂联素及其多态性与2 型糖尿病及胰岛素抵抗有学者［23］认为，脂联素单核苷酸多态性也与脂联素的生成和分泌的减少有关，这可能也是导致胰岛素抵抗及2 型糖尿病发生的原因。脂联素基因具有多个多态性的位点，有研究已经表明其与糖尿病、代谢综合征等发病相关。随着SNPs 分析技术的发展，至今已发现上百个常见的基因变异与2型糖尿病密切关联［10］。

本研究采用RFLP-PCR技术检测180例2 型糖尿病和192例正常人群的脂联素rs1063539和rs3821799 位点的基因分布，结果证实rs1063539 存在C→G的突变，rs3821799 存在C→T的突变，这与NCBI 数据库的信息一致。比较rs1063539，3种基因型的组间分布，差异具有统计学意义（P=0.04），提示脂联素基因rs1063539 位点多态性可能与广东地区2型糖尿病相关。而比较rs3821799位点，3种基因型分布组间差异无统计学意义（P=0.93），提示脂联素基因rs1063539 位点多态性可能与广东地区2 型糖尿病无相关性。

脂联素rs1063539 位点突变后共有CC、CG、GG，3种基因型，两两比较发现杂合子GC 与变异性纯合子GG的分布频率差异有统计学意义（P=0.013），杂合子GC 基因型的OR为1.724，95%CI为1.124～2.645，即GC 是GG 患2 型糖尿病风险的1.724 倍；若合并野生型纯合子CC和杂合子GC 与变异性纯合子GG 比较，其分布频率差异有统计学意义（P=0.014），CC+GC是GG患病率的1.292倍，OR=1.292，95%CI：1.052～1.587。对于脂联素rs3821799 位点，3种基因型两两比较差异无统计学意义（均P＞0.05）；若将野生型纯合子CC 与杂合子CT 合并，与变异性纯合子TT 比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；同样，将变异性纯合子TT与杂合子CT 合并，与纯合子CC 比较，差异性无统计学意义（P=0.961）。

排除性别及年龄的影响，调整协变量，对其进行较正，可得出脂联素rs1063539 位点3种基因型的分布，GC 与GG的分布频率差异仍具有统计学意义（P=0.029），OR值为1.725，95%CI为1.057～2.816，即GC 是GG 患2 型糖尿病风险的1.725 倍；若合并野生型纯合子CC和杂合子GC 与变异性纯合子GG 比较，其分布频率差异也统计学意义（P=0.045），CC + GC 是GG 患病率的1.269 倍，OR=1.269，95%CI：1.005～1.602。对于脂联素rs3821799 位点的3种基因型，3种基因型两两比较，差异无统计学意义（均P＞0.05），若将野生型纯合子CC 与杂合子CT 合并，与变异性纯合子TT比较，差异无统计学意义（P=0.208），同样，将变异性纯合子TT 与杂合子CT 合并，与纯合子CC 比较，也差异无统计学意义（P=0.349）。

本研究结果指出，脂联素基因rs1063539 位点多态性可能与广东地区2 型糖尿病呈相关性，患病风险较高的是GC 基因型和CC+GC 基因型，变异性纯合子GG 患病率则小于其他基因型。可见，变异型纯合子具有降低2 型糖尿病的危险性的作用，而突变杂合子GC 基因型的人群则较易发生2 型糖尿病。而脂联素基因在rs3821799 多态性可能与广东地区2 型糖尿病无相关，但尚需进一步研究证实。

国内外学者一致认为，2 型糖尿病是一种极其复杂的内分泌和代谢紊乱疾病，也是具有明显异质性的多因素、多基因遗传病，环境因素、饮食习惯、性别、年龄和种族因素都可能对疾病的发展造成影响，JANICE等［24］和WANG等［25］的研究也表明，rs1063539 在中国香港人群和中国福建的汉族人群中可能与2 型糖尿病密切相关，但国外尚未发现关于此位点基因型的相关报道。JANICE等［24］、NIINA等［8］和杜文聪等［26］的研究结果，都认为rs3821799 多态性可能与2 型糖尿病无相关性。这与本文的研究结果基本吻合。

本研究显示病例组rs1063539 基因型CC 分别与CG、GG 对应的TG 比较，P值分别为0.04、0.01，提示rs1063539 不同基因型可能影响甘油三酯的代谢，rs3821799 各基因型对应生化指标差异无统计学意义（P＞0.05），提示脂联素rs3821799SNP 位点没有影响血脂代谢。

综上所述，可以得出rs1063539 可能与T2DM相关，基因型GC 可能具有较高的T2DM 易感性。脂联素rs3821799 可能与广东地区T2DM 无相关性。而本文研究的脂联素在地区，年龄，种族，饮食习惯和生活的地域、气候等因素等，都比较局限。在以后的研究中，拟通过扩大研究地域范围，增加BMI、年龄、性别等因素分析比较，增大样本量进一步探究，让研究数据更具代表性，更能阐明脂联素rs1063539和rs3821799 与T2DM 之间的关系。