电子鼻快速检测乌龙茶挥发物条件的优化

王蔚 魏日凤 郭雅玲

摘  要  本研究利用单因素试验结合L9（34）正交试验，以10个传感器特征值为考察指标，确定了茶样量、平衡温度、平衡时间3种因素的最佳萃取条件。结果表明，不同萃取条件对不同传感器响应值的影响程度不同，平衡温度对绝大多数传感器特征值的影响最大，而平衡时间的影响最小。试验得出的电子鼻检测乌龙茶挥发物的最优条件为：平衡温度100 ℃，平衡时间45 min，茶样量为3 g。在此萃取条件下试验重复性好，传感器响应曲线较为密集平稳且响应值最高，可将13个不同品种的乌龙茶明显区分开。该试验为乌龙茶香气的快速客观判别提供了有效的电子鼻检测方法。

关键词  乌龙茶;电子鼻;正交试验;最优萃取条件;挥发性成分

中图分类号  S571.1      文献标识码  A

乌龙茶属半发酵茶，因其具有丰富多样而又独特的花果香，深受消费者喜爱。茶叶的香气作为茶叶品质鉴定的重要因子之一，密切影响茶叶品质等级的划分，其品质评价和组成成分的分析一直是茶叶科研领域的一项重要课题。为了客观系统地检测乌龙茶的挥发物以进行产地判别、真伪判别、香型归类，运用仪器辅助检测乌龙茶挥发物意义重大。

茶叶香气分析方法有感官审评法、电子鼻分析法、GC-O分析法及GC-MS（气相色谱-质谱联用仪）分析法等。其中电子鼻是一种与生物嗅觉原理相似的仪器，气味分子被传感器吸附，产生的信号经处理加工与传输，再经模式识别做出判断，最终实现快速识别简单或复杂气体[1]。电子鼻既能识别单一挥发性有机化合物，又能对复杂的气味给出整体综合判别，不仅具备传统常规仪器[2]分析的客观性、不易疲劳、重现性好等优点，而且易获得被测样品的气味整体信息，具有操作简单、鉴别速度快、成本低、无损检测等优点。目前电子鼻已广泛应用于不同贮藏时间[3]、不同等级[4-5]、不同产地[6]、不同加工工艺[7]、不同冲泡条件[8]等茶样的研究。也有不少人对样品的处理方式以及电子鼻检测参数等进行了优化。2013年，敖存等[9]实验中通过比较不同茶样量、茶水比、水浴温度和时间条件下茶叶的香气特点，确定了茶粉法、喷雾法和叶底法的方法参数。结果表明，茶粉法条件下，电子鼻不同传感器的响应值较高，重复性较好，并能够良好地反映感官评审结果，较好地区分不同等級龙井茶香气质量差异，明显好于其他3种方法。2017年，高林等[10]研究发现，茶粉法相比茶汤法，响应值略低，但是茶粉法具有较好的重复性和区分性，操作简单，也不会对仪器造成损害，适用于普洱茶电子鼻的分析。2018年，何鲁南等[6]分别用干茶法、茶汤法、叶底法对茶样香气进行采集。结果表明，相较于其他方法，叶底法对不同贮藏地的普洱茶的区分效果更佳。但是前人研究中使用的样品处理方法多为叶底、茶汤、完整的干茶样或者茶粉加水，用茶粉直接进行电子鼻检测的较少。

本研究以肉桂为材料，通过单因素和正交试验，对影响电子鼻灵敏度的主要因素的参数进行了优化，确定了较佳的平衡温度、平衡时间和茶样量3个样品前处理方法参数，建立了乌龙茶香气物质的可靠分析方法，并对该方法进行了稳定性考察以及乌龙茶样品的检测，以期为乌龙茶天然香气成分的开发和利用、判别产地、鉴定真伪提供科学依据。

1  材料与方法

1.1  材料

选取2017年正岩肉桂（乌龙茶，福建省武夷山市宏业茶业有限公司），磨碎，过40目筛，装于铝箔袋，密封备用。

iNose型电子鼻，上海昂申智能科技有限公司，由10个金属传感器按一定阵列组合而成，传感器及其响应的挥发性成分见表1;灵敏度为万分之一的电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;WK-400B高速药物粉碎机，山东青州市精诚机械有限公司;KQ-600KDE型高功率数控超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司;电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司;40目标准检验筛，上虞市银河测试仪器厂;60 mL顶空瓶，厦门仪谱仪器有限公司。

1.2  方法

1.2.1  实验设计  选取平衡温度、平衡时间、茶样量这3个因素同时作为考察因素，首先采用单因素试验确定其较优水平变化范围后，再采用正交试验优化并确定乌龙茶挥发物的最佳电子鼻检测分析条件。

（1）单因素试验设计。每个处理重复5次，比较不同处理下各传感器的特征值（包括最大值与稳定值）大小，同时考察传感器特征值绝对值的RSD值大小。

平衡温度设定为20、40、60、80、100、120 ℃。

根据吕海鹏等[11]的研究结果及预试验结果，将平衡时间设定为15、30、45、60、75 min。

根据电子鼻顶空瓶大小，将茶样量设定为0.5、1、2、3、4 g。

（2）正交试验影响因素及水平的选择。根据单因素试验筛选出较优的平衡温度、平衡时间以及茶样量条件范围，分别选择3个水平，其中平衡温度为60、80、100 ℃，平衡时间为15、30、45 min，茶样量为1、2、3 g。以电子鼻10个传感器的特征值及其响应曲线的线形为考察指标，选用L9（34）正交试验表（表2）得出最优条件。

1.2.2  电子鼻测定方法  （1）电子鼻条件。电子鼻载气为净化空气（相对湿度在60% ± 1%），气体流量为0.8 L/min，采样时间为300 s，等待时间为10 s，样品清洗时间为360 s。

（2）电子鼻测定方法。准确称取一定质量的乌龙茶茶粉（精确至0.0001 g）置于60 mL顶空瓶内备用，设置好样品的平衡温度与平衡时间。单因素试验中每个样品重复测定5次，正交试验每个样品重复测定3次，稳定性试验样品重复测定5次。命名时重复1为编码-1、重复2为编码-2，其他依此类推。

步骤：开机后仪器预热（30 min）→清洗传感器3次（每次120 s）至各传感器响应值趋向于 1.0000 →检测样品（自带清洗传感器 120 s，等待时间 10 s，信号采集）→记录对应的特征响应值→保存数据。

（3）稳定性考察。取乌龙茶茶样3 g，重复5次，按最终的优化参数进样和检测。得到结果后，分别考察电子鼻10个传感器特征值的相对标准偏差（RSD）。

1.3  数据处理

数据采用Excel软件进行极差分析并作图，采用SPSS 21软件邓肯法进行方差分析。

2  结果与分析

2.1  单因素试验结果

对从电子鼻系统中导出的特征值进行方差分析，结果表明茶样量、平衡温度对10个传感器均有极显著影响，平衡时间只对s1、s2、s4有极显著影响，对其他传感器均无显著性影响。

2.1.1  平衡温度对电子鼻各传感器响应值的影响  随着平衡温度的升高，乌龙茶电子鼻10个传感器响应值的最大值与稳定值逐渐增大（图1）。平衡温度为20 、40 ℃时，10个传感器的响应值无显著性差异，平衡温度为40 、60 ℃时，除了s1、s8，其他8个传感器的响应值也均无显著性差异。除了s3同类子集中的组均值大小排序为120 ℃> 100 ℃>80 ℃>60 ℃>20 ℃>40 ℃，其他9个传感器特征值同类子集中的组均值从大到小排序均为120 ℃>100 ℃>80 ℃>60 ℃>40 ℃>20 ℃。当平衡温度为20 ℃和40 ℃时，电子鼻响应值最大值较低（最高值仅至3.5），且线条杂乱不平稳;当平衡温度为120 ℃时，电子鼻响应值最大值较高，可达22左右，但同一个处理重复性差，检测结束时，s1、s2、s6、s10等传感器响应值仍有较大下降趋势，不稳定，表明电子鼻中仍有一部分气体物质没有检测完。而当平稳温度为60、80、100 ℃时，电子鼻响应值线性流畅平稳，响应值最大值与稳定值较高，稳定值的RSD值除80 ℃中s1与s9小于6.5%，其余均小于5%，表明这3个温度梯度均具有较好的重复性，故选择60、80、100 ℃继续进行正交试验。

图 1  不同平衡温度下10个传感器稳定值的大小

Fig. 1  Steady-state values of 10 sensors at different equilibrium temperatures

2.1.2  平衡时间对电子鼻各传感器响应值的影响  平衡时间只对s1、s2、s4的响应值有极显著影响，对其他传感器均无显著性影响（图2）。s2、s4平衡时间为15 min时，同类子集中的组均值最大，其次是30和45 min，虽然s1平衡时间为75和60 min时该传感器响应值比较高，但30、45与60 min的响应值无显著性差异，综合考虑后选择15、30、45 min进行正交试验。

2.1.3  茶样量对电子鼻各传感器响应值的影响  从图3可知，随着茶样量的增多，传感器特征值平均值整体上呈上升趋势，3 g接近平台期。s1、s3、s8、s9同类子集中的组均值大小排序为3 g >

4 g > 2 g > 1 g > 0.5 g，对于其他传感器而言，同类子集中的组均值大小排序均为4 g > 3 g > 2 g >

1 g > 0.5 g，除了s3、s5、s6、s7、s8、s10中3 g与4 g有显著性差异外，其他传感器3 g与4 g的响应值均无显著性差异。大多数传感器中1 g的响应值均显著大于0.5 g的响应值（除了s8、s9），同时1、2、3 g彼此之间有显著性差异（除了s3和s8）。综合考虑，选择1、2、3 g进行正交试验。

2.2.1  正交试验极差分析  电子鼻优化出的最优传感器为s3、s4、s5、s7、s10。由表4中的极差（R值）分析结果可以看出，10个传感器由极差分析得出的较优组合均为A3B1C3，即100 ℃、45 min、3 g。3个因素对s2、s4、s6响应值影响大小的排序为茶样量>平衡温度>平衡时间（C>A>B）。对其他传感器而言，平衡温度对其响应值影响最大，其中s1、s5、s7、s9、s10的因素影响力大小排序为，平衡温度>茶样量>平衡时间（A>C>B），s3、s8的因素影响力大小排序为平衡温度>平衡时间>茶样量（A>B>C）。

2.2.2  正交试验方差分析  正交试验对电子鼻10个传感器响应值影响的方差分析见表5。平衡温度对所有传感器均有极显著影响。平衡时间对s1、s3、s8、s9有极显著影响，对s5、s7有显著性影响，对s2、s4、s6、s10无显著性影響。茶样量对s3无显著性影响，对其他传感器均有极显著影响。

由方差分析可知，以平衡温度为考察指标时，10个传感器同类子集中的组均值大小排序均为100 ℃>80 ℃>60 ℃，且100 ℃的响应值均与80 ℃和60 ℃有极显著差异，故最优平衡温度为100 ℃。

以平衡时间为考察指标时，10个传感器同类子集中的组均值最大的平衡时间均为45 min，不考虑对电子鼻响应值无显著影响的4个传感器，除了s7外，其他传感器中45 min的响应值大小与15、30 min均有极显著差异，故最优平衡时间为45 min。

以茶样量为考察指标时，10个传感器同类子集中的组均值大小排序均为3 g>2 g>1 g，且s1、s2、s4、s5、s7、s9、s10中3 g的响应值均与2 g存在显著差异，故最优茶样量为3 g。

综上由方差分析得出的最优组合为A3B1C3，即100 ℃、45 min、3 g，与极差分析结果相同。

2.2.3  正交试验结果分析  根据正交试验的极差分析与方差分析结果，得出乌龙茶电子鼻检测的最优条件为A3B1C3，即平衡温度100 ℃，平衡时间45 min，茶样量3 g。

2.3  电子鼻方法学考察

为考察优化方法的稳定性，对乌龙茶茶样进行5次重复取样，分别以优化的参数进样分析。结果表明，在5次重复中，除了s6、s7、s10的特征值平均值RSD小于7%，其余传感器的特征值平均值RSD均小于5%，说明该方法的稳定性较好，符合检测要求。用这个方法作为乌龙茶香气分析检测手段试验结果真实可靠，为乌龙茶香气组分的进一步研究打下了良好的基础。

图4为电子鼻采集乌龙茶样品香气的传感器响应信号强度图。横坐标表示采集时间，纵坐标表示传感器响应强度，每条曲线表示1个传感器在300 s内的响应信号变化值（相对电导率G/G0）。从图4可以看出，从测定的初始阶段到样品气体的平稳过程中，其变化是先曲线上升后下降，最后趋于平缓，其中s1（氨气、胺类）、s2（硫化氢、硫化物）、s6（甲烷、沼气、碳氢化合物）的响应值变化比其他传感器更高。通过电子鼻传感器对乌龙茶茶样挥发性物质的响应试验可知，电子鼻对乌龙茶挥发性物质有明显的响应，且每一个传感器对其响应值各不相同，表明利用电子鼻系统识别不同品类乌龙茶可行。

2.4  电子鼻检测最优条件下不同乌龙茶的香气轮廓考察

在电子鼻检测最优条件下，对13个不同品种乌龙茶（奇丹、肉桂、水仙、矮脚乌龙、十里香、雀舌、金观音、黄观音、北斗、梅占、半天腰、瑞香、奇兰）的香气分别进行了检测，结果见图5和图6。主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）利用降维的思想，把多指标转化为少数几个综合指标，简化分析过程[12-14]，而线性判别分析（linear discrimination analysis，LDA）注重类别的差异以及各种组之间的距离分析[5]。在PCA和LDA中气味特征越相似，数据分布越紧密，气味特征差异越大，数据分布越分散。

在PCA图中（图5），2个主成分累计贡献率为87.1%，表明该结果可有效区分不同品种乌龙茶的气味，但部分乌龙茶数据组发生重叠，如十里香、半天腰、雀舌与黄观音、金观音与肉桂，而在LDA图中（图6），13个茶样的电子鼻数据组之间基本无重叠（仅十里香、瑞香、雀舌轻微重叠），区分度较好，这主要是PCA与LDA的运算模式不同，但是在本研究中LDA更有利于不同品种乌龙茶的区分。

13个茶样中，奇丹、奇兰、金观音、黄观音、半天腰分布在LDA图的外源，彼此之间差异较大，且与其他茶样分隔开来，说明这几个茶样具有独特的香气品质，可以与其他茶样明显区分，而肉桂与水仙差异不大，雀舌、瑞香、北斗、十里香紧密聚合，显示出相近的品质特征。

3  讨论

目前，通过电子鼻检测茶叶香气，主要通过采集茶叶中干茶[15]、叶底或茶汤[16]香气、茶汤香气的直接混合制备法[17]的方式进行分析。前3种多存在样品内重复性差、样品间差异性不显著等问题，而最后一种将茶和冷水直接在顶空瓶中混合，当需要检测此茶样时，才要求在同一温度下顶空加热同一时间使之释放香气，然后取香气进入电子鼻，具有香气不易散失、客观性强、保证样品间的香气可比性、提高试验效率等优点，同时使电子鼻传感器的响应强度提高[17]。但在本研究中，前期预试验发现加水的茶样经过一段时间的平衡加热后，电子鼻检测出来的雷达图不稳定，响应曲线多波动，效果不好，故采用茶粉法进行单因素试验和正交试验。

通过对乌龙茶挥发性成分电子鼻工艺的单因素试验和正交试验分析，以10个传感器的响应值为依据，确定了乌龙茶挥发性成分电子鼻检测的最佳参数，即平衡温度为100 ℃，平衡时间为45 min，茶樣量为3 g。在此基础上，对13个不同品种的乌龙茶香气进行了电子鼻检测，观察电子鼻对其分类效果，发现LDA对茶样的区分效果由于PCA，且在LDA图中，13个茶样的电子鼻数据组之间基本无重叠（仅十里香、瑞香、雀舌轻微重叠），区分度较好，说明优化的方法适用于乌龙茶香气物质的检测。综上，本研究建立了适用于乌龙茶香气物质分析的仪器分析可靠方法，该方法操作简便快捷，实践性强，为乌龙茶提供了电子鼻快速检测判别的试验方法。

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