应用RAD多肽展示体系制备抗hCG类抗体分子

刘梦雯，王美，王琼，辛化伟,2

1 武汉科技大学 生命科学与健康学院，湖北 武汉 430065

2 临沂大学 药学院，山东 临沂 276000

人绒毛膜促性腺激素 (hCG) 是人正常妊娠及某些恶性肿瘤发生中产生的多肽类激素[1-3]。hCG由胎盘合体滋养层细胞分泌，由α和β两个亚基组成，以二硫键将其连结在一起形成二聚体结构[4-5]。hCG的α亚基与LH、TSH及FSH的α亚基基本相似，而β亚基的结构却不一样，hCG的生物学活性和免疫学特性主要取决于β亚基[6-7]。hCG-β也是正常妊娠及相关失调、妊娠滋养细胞疾病的标识分子。另外，近期研究发现，在其他非滋养细胞来源的恶性肿瘤如卵巢癌、膀胱癌、结肠癌中，也显示hCG-β的异常表达。因此，利用特异性的hCG结合分子检验血和尿中的hCG水平，在检测极早期妊娠及恶性肿瘤过程中起着至关重要的作用。

当前包括hCG-β在内的疾病标识分子的临床检验一直沿用基于单克隆抗体的免疫检测技术[8-9]。近年来，随着体外蛋白质 (及非蛋白质)识别分子技术的发展，应用非抗体蛋白骨架、通过多肽嫁接或置换筛选技术获得特定蛋白的亲和分子的方法逐渐受到人们的重视，并开始用于实验室医学分子检验的尝试。但是，由于大多数蛋白骨架的可变位点有限，可容许大片段多肽嫁接的蛋白骨架较少，导致多肽嫁接后不能有效地结合目标分子。近期有研究报道，一种应用嗜热古菌Pyrococcus furiosus的重组酶RadA分子的球形ATP酶结构域的蛋白质骨架 (简称RAD骨架)，可接纳多肽、完整结构域甚至全长蛋白的插入、嫁接，具有其他蛋白质骨架所没有的高度灵活性，并可在细菌中表达和快速生产，引起了研究者的注意[10]。这种蛋白质骨架还具有很高的热稳定性，不含半胱氨酸残基，能容忍表面突变和缺失[11-12]。利用RAD骨架建立的多肽或蛋白展示体系 (RAD display) 制备类抗体分子，有望用于医学标识分子等的检测[13-14]。因此，本研究以hCG为检验分子，尝试制备其RAD嫁接类抗体分子，并与单域嫁接抗体及商业单克隆抗体进行抗原结合活性比较，检验其应用潜力。

1 材料与方法

1.1 材料

pET30a(+) 质粒、pET30a(+)-sfGFP质粒由本实验室构建；重组抗hCG-α抗体、重组抗hCG-β抗体-sfGFP融合蛋白 (cAbBCII10-CDR1/hCGBP1-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP)，pCDNA3-hCG-α、LHB (促黄体生成素β亚基) 表达质粒，hCG-α+LHB转染293T细胞分泌上清，由本实验室制备；大肠杆菌E.coliDH5α和大肠杆菌E.coliBL21(DE3) 感受态细胞均由本实验室制备；BCA蛋白含量检测试剂盒购于碧云天公司；JEG-3细胞购于武汉普诺赛公司；hCG Antigen购自上海领潮公司；Anti-hCG-β/FITC购自北京博奥森公司；各种限制性内切酶购自TaKaRa公司；T4 DNA连接酶购自Thermo Scientific公司；Ni-NTA亲和柱购自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；基因合成由杭州金唯智公司完成；DNA测序由武汉擎科生物技术有限公司完成。

1.2 原核表达载体的构建

全基因合成P.furiosus重组酶RadA的ATPase结构域 (RAD展示骨架) 基因，在其上、下游分别引入BglⅡ和SalⅠ酶切位点，将其用BglⅡ和SalⅠ进行双酶切，pET30a-sfGFP质粒用BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离，然后用T4 DNA连接酶将胶回收后的RAD基因片段和pET30a-sfGFP酶切DNA产物于22 ℃连接2 h，转化至大肠杆菌E.coliDH5α，挑取单菌落培养后提取质粒进行EcoR Ⅴ和SalⅠ双酶切鉴定，并将双酶切鉴定正确的阳性克隆送至武汉擎科生物技术有限公司测序。质粒图谱如图1A所示。

全基因合成hCG结合多肽插入RAD骨架L2环的嫁接RAD (后简称RAD/hCGBP) 基因序列，同样在其上、下游分别引入BglⅡ和SalⅠ酶切位点，克隆到pET30a-sfGFP载体中，转化至大肠杆菌E.coliDH5α，挑取单菌落培养后提取质粒进行EcoR Ⅴ单酶切鉴定，并将酶切鉴定正确的阳性克隆送至武汉擎科生物技术有限公司测序。质粒图谱如图1B所示。

1.3 类抗体蛋白的表达

将质粒pET30a-RAD-sfGFP和pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP分别转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)。分别挑取单克隆菌落摇种子，按1∶60 (V/V) 的接种量转接。当OD值为0.6时，取部分未诱导菌液作为阴性对照。剩余部分加入0.5 mmol/L IPTG于18 ℃低温诱导12 h，离心收集菌体沉淀，取一部分菌体沉淀用于检测全菌蛋白；另一部分加入9倍体积的Buffer H缓冲液 (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mol/L NaCl，10%甘油，10 mmol/L β-巯基乙醇，30 mmol/L咪唑)，1倍体积10 mg/mL溶菌酶，0.1倍体积0.1 mol/L PMSF，混匀，冰浴超声破碎20 min，离心分离上清和沉淀，用12% SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检测菌体全蛋白与超声破碎后上清和沉淀中的蛋白。

1.4 类抗体蛋白的纯化与SDS-PAGE鉴定

在适宜的诱导条件下 (18 ℃，120 r/min) 诱导类抗体蛋白的表达。收集诱导后菌体、取超声破碎菌体后的裂解液上清，按照产品说明书，与Ni-NTA亲和柱 (柱子平衡缓冲液：上述Buffer H)充分结合，以含0.075 mol/L咪唑的Buffer H洗脱杂蛋白，接着使用新鲜配制0.3 mol/L咪唑的H-Buffer洗脱目的蛋白，分别收集亲和柱穿透峰和洗脱峰，用12% SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检测收集的蛋白。收集洗脱峰蛋白，透析去除咪唑。类抗体蛋白RAD-sfGFP和RAD/hCGBPsfGFP的理论分子量分别为57 kDa和58 kDa。

图1 pET30a-RAD-sfGFP和pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP质粒图谱Fig.1 Plasmid maps of pET30a-RAD-sfGFP and pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP.(A) Plasmid map of pET30a-RAD-sfGFP.(B) Plasmid map of pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP.

1.5 类抗体蛋白浓度及抗原结合活性的测定

按照BCA蛋白含量检测试剂盒说明书，测定样品的蛋白浓度。

类抗体蛋白的抗原结合活性采用亲和吸附-GFP荧光检测方法进行测定。用包被缓冲液(碳酸盐缓冲液pH 9.6，含5%新生牛血清)将anti-hCG-α稀释至1 μg/mL，在每个96孔聚苯乙烯发光板的反应孔中加0.1 mL上述抗体稀释液，4 ℃包被过夜。第二天，弃去孔内溶液，用PBST洗涤缓冲液瞬时洗3次，3 min/次，第3次要弃净孔中溶液 (此过程为洗涤，下同)。分别加一定梯度稀释JEG-3细胞 (人绒毛膜癌细胞：该细胞是从Erwin-Turner肿瘤的Woods系分离建立的6个克隆中的一个，可产生hCG) 分泌上清或hCG Antigen 0.1 mL于上述已包被孔中，37 ℃孵育1 h后洗涤，同时做空白孔对照。然后于各反应孔中，分别加入0.1 mL同浓度的RAD-sfGFP、RAD/hCGBP-sfGFP、cAbBCII10-CDR1/hCGBP1-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP (应用单域抗体通用骨架cAbBCII10，以hCG结合多肽取代互补决定区CDR1或CDR3，制备的具有一定抗原结合活性的抗hCG单域抗体分子)、Anti-hCG-β/FITC，37 ℃孵育1 h，洗涤。于各反应孔中加入0.2 mL的PBS，于酶标仪上检测荧光强度，激发光和荧光检测波长分别为488 nm和525 nm。

1.6 类抗体蛋白滴度测定

按照同上包被步骤进行包被，加一定相同浓度JEG-3细胞分泌上清0.1 mL于已包被的反应孔中，37 ℃孵育1 h后洗涤，同时做空白孔对照。于各反应孔中，分别加入0.1 mL一定稀释浓度的RAD/hCGBP-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP、Anti-hCG-β/FITC，37 ℃孵育1 h，洗涤。于各孔中加入0.2 mL的PBS，检测荧光强度。

1.7 类抗体蛋白的抗原结合特异性测定

按包被步骤进行包被，分别加一定相同浓度JEG-3细胞分泌上清或hCG-α+LHB转染293T细胞分泌上清0.1 mL于上述已包被反应孔中，置37 ℃孵育1 h后洗涤，同时留空白孔对照。于各反应孔中分别加入 0.1 mL相同浓度的RAD/hCGBP-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP、Anti-hCG-β/FITC，37 ℃孵育1 h，洗涤。于各孔中加入0.2 mL的PBS，检测荧光强度。

1.8 类抗体蛋白的生化稳定性测定

分别将RAD/hCGBP-sfGFP和cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP与足量的DP-GFP (一种GFP结合蛋白，本实验室制备) 混匀，保证GFP标签的稳定性。取等份的上述混合物及Anti-hCG-β/FITC抗体分别置于4 ℃、16 ℃、37 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃的水浴锅中水浴30 min，取出，恢复至室温。各取100 μL上清于聚苯乙烯板中，检测其荧光强度，分析类抗体蛋白的热稳定性。

取等份上述混合物及Anti-hCG-β/FITC抗体，用伯瑞坦-罗宾森 (Britton-Robinson) 广泛缓冲液 (H3PO4-HAc-H3BO3) 调pH至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，于4 ℃放置30 min，取出，待恢复至室温。各取100 μL于聚苯乙烯板中，检测其荧光强度，分析类抗体蛋白的酸碱稳定性。

2 结果与分析

2.1 原核表达载体的构建

重组子pET30a-RAD-sfGFP经EcoRⅤ和SalⅠ双酶切鉴定后，结果所得2条目的带大小大约为721 bp和5.4 kb，pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP重组子经EcoRⅤ单酶切鉴定后得到2条目的带大小约为603 bp和5.5 kb，结果符合预期 (图2)。酶切正确的重组质粒经测序结果证实，连入载体的目的序列与预期序列一致，密码子阅读框准确无误，说明两个重组质粒构建正确。

图2 重组质粒pET30a-RAD-sfGFP和pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP的构建Fig.2 Construction of pET30a-RAD-sfGFP and pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP recombinant plasmid.M1：1 kb DNA marker;M2：100 bp DNA marker;1：digestion of pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP with EcoRⅤ;2：digestion of pET30a-RAD-sfGFP with EcoRⅤand SalⅠ.

2.2 类抗体蛋白的表达

将pET30a-RAD-sfGFP和pET30a-RAD/hCGBPsfGFP重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，收集细菌进行SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色结果(图3) 显示，IPTG诱导后的E.coliBL21(DE3)/pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP和E.coliBL21(DE3)/pET30a-RAD-sfGFP可见明显的蛋白诱导条带。这两种蛋白在上清与沉淀中均有显示，在上清中较多，说明可通过纯化可溶性蛋白的方式纯化目的蛋白。

2.3 Ni-NTA亲和层析柱纯化类抗体蛋白

将两个重组质粒pET30a-RAD-sfGFP和pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP转化大肠杆菌诱导表达超声后收集的上清，经Ni-NTA亲和柱纯化后，用不同浓度的咪唑洗脱液进行洗脱，获得较高纯度的类抗体蛋白，SDS-PAGE检测分析纯化结果(图4) 表明，两个转化菌株的菌体裂解液上清样品分别在约57 kDa和58 kDa位置有特异性蛋白条带，与类抗体蛋白理论分子量大小相近，表明成功纯化得到目的蛋白。

图3 类抗体蛋白RAD/hCGBP-sfGFP和RAD-sfGFP的表达Fig.3 Expression of RAD/hCGBP-sfGFP and RAD-sfGFP fusion proteins.M：marker (10-170 kDa);1：E.coli BL21(DE3)/pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP,uninduced;2：E.coli BL21(DE3)/pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP,IPTG induced;3：pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP supernatant,IPTG induced;4：pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP precipitate,IPTG induced;5：E.coli BL21(DE3)/pET30a-RADsfGFP,uninduced;6：E.coli BL21(DE3)/pET30a-RADsfGFP,IPTG induced;7：pET30a-RAD-sfGFP supernatant,IPTG induced;8：pET30a-RAD-sfGFP precipitate,IPTG induced.

2.4 类抗体蛋白的浓度与抗原结合活性分析

通过BCA蛋白测定法可以得出RAD-sfGFP和RAD/hCGBP-sfGFP两个类抗体蛋白的浓度分别为1.97 mg/mL、2.95 mg/mL。以anti-hCG-α蛋白作为捕获抗体，以JEG-3细胞分泌含有hCG抗原的上清作为抗原，分别以RAD-sfGFP、RAD/hCGBP-sfGFP、cAbBCII10-CDR1/hCGBP1-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP和Anti-hCG-β/FITC为探测抗体测定与hCG的结合活性，结果如图5所示。除空白对照RAD-sfGFP外，其他4种蛋白对hCG均有一定结合活性，其中RAD嫁接类抗体 (RAD/hCGBP) 的抗原结合活性高于CDR3嫁接抗体 (CDR3/hCGBP3) 和CDR1嫁接抗体 (CDR1/hCGBP1)，且具有不低于Anti-hCG-β/FITC抗体的结合活性。

图4 类抗体蛋白RAD-sfGFP和RAD/hCGBP-sfGFP的纯化Fig.4 Purification of RAD-sfGFP and RAD/hCGBP-sfGFP fusion proteins.(A) Purification of RAD-sfGFP fusion proteins.M：protein Mw marker (10-170 kDa);1：E. coli BL21 (DE3)/pET30a-RAD-sfGFP supernatant;2：flow-through of Ni-NTA affinity chromatography resin;3-6：elutions of Ni-NTA affinity chromatography resin.(B) Purification of RAD/hCGBP-sfGFP fusion proteins.M：protein Mw marker(10-170 kDa);1：E. coli BL21 (DE3)/pET30a-RAD/hCGBP-sfGFP supernatant;2：flow-through of Ni-NTA affinity chromatography resin;3-6：elutions of Ni-NTA affinity chromatography resin.

图5 类抗体蛋白RAD/hCGBP-sfGFP结合hCG抗原 (JEG-3分泌上清) 的活性检测Fig.5 Determination of hCG-binding affinity of RAD/hCGBP-sfGFP fusion proteins (hCG antigen from the supernatant of JEG-3 cells).(A) hCG-binding curve against Ag (antigen) relative concentration.(B) hCG-binding curve against log2 of Ag (antigen) relative concentration.

以anti-hCG-α蛋白作为捕获抗体，以商业化的hCG Antigen作为抗原，分别以上述5个蛋白为探测抗体测定与hCG的结合活性，结果如图6所示。与单域抗体通用骨架嫁接的抗体相比，RAD嫁接类抗体 (RAD/hCGBP) 对不同来源的hCG抗原均展现了较高的结合活性。

2.5 类抗体蛋白的滴度分析

分别以梯度稀释的RAD/hCGBP-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP和Anti-hCG-β/FITC为探测抗体测定与hCG抗原 (JEG-3细胞分泌上清) 的结合活性，结果如图7所示，3种分子结合hCG抗原的滴度测定曲线相似，滴度均为1∶20。

图6 类抗体蛋白RAD/hCGBP-sfGFP结合hCG抗原 (hCG Antigen) 的活性检测Fig.6 Determination of hCG-binding affinity of RAD/hCGBP-sfGFP fusion proteins (hCG antigen from the hCG Antigen).(A) hCG-binding curve against Ag (antigen) relative concentration.(B) hCG-binding curve against log2 of Ag(antigen) relative concentration.

图7 类抗体蛋白RAD/hCGBP-sfGFP的滴度分析Fig.7 Analysis on titer of RAD/hCGBP-sfGFP fusion proteins.

2.6 类抗体蛋白的抗原结合特异性分析

以JEG-3培养细胞上清液或hCGα+LHB转染的293T细胞上清液作为抗原，以RAD/hCGBPsfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP或AntihCG-β/FITC为探测抗体，分别测定对两种相似抗原 (hCG 和LH) 的结合特异性，结果如图8所示，3种蛋白对hCG的结合活性均高于对LH的结合活性，差异显著性相关 (P＜0.01)，并对LH存在一定的交叉结合活性；且RAD/hCGBP- sfGFP对hCG的结合特异性相对较高。

图8 类抗体蛋白RAD/hCGBP-sfGFP的特异性分析(**P<0.01)Fig.8 Analysis of specificity of RAD/hCGBP-sfGFP fusion proteins (**P＜0.01).

2.7 类抗体蛋白的稳定性

通过图9A可以看出，温度对3种蛋白RAD/hCGBP-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP和Anti-hCG-β/FITC的稳定性均有很大影响。在37-50 ℃内其稳定性较好，在70 ℃时几乎完全丧失稳定性。同样，通过图9B可以看出，pH对3种蛋白RAD/hCGBP-sfGFP、cAbBCII10-CDR3/hCGBP3-sfGFP和Anti-hCG-β/FITC的稳定性也有很大影响。稳定性在pH＜7的范围内随pH的降低而降低，在pH为4时几乎丧失稳定性，在pH＞8的范围内稳定性开始下降。

图9 类抗体蛋白RAD/hCGBP-sfGFP的稳定性分析Fig.9 Analysis of stability of RAD/hCGBP-sfGFP fusion proteins.(A) Stability of antibody protein at different temperature conditions.(B) Stability of antibody protein at different pH conditions.

3 讨论

应用抗体/类抗体蛋白骨架制备新嫁接抗体/类抗体的技术是一种改善结合多肽的生化性能的重要手段[15]。理想的类抗体蛋白骨架具有分子量小、高水溶性和热稳定性等生化特征，其可以允许插入多肽、甚至更大的结构性肽段。在本项工作中，我们以来源于嗜热古菌P.furiosus的RAD蛋白骨架制备hCG结合多肽的嫁接类抗体[4]，展示了优异的hCG结合活性，并且嫁接类抗体的生化稳定性等均与经典途径制备的商业单克隆抗体相近[16-17]，暗示RAD骨架可能是一种较理想的多肽展示蛋白骨架。

应用多肽展示技术制备抗hCG抗体的工作已有研究者进行尝试[18]。本研究结合前期研究对hCG结合多肽筛选工作和单域抗体通用骨架的选择、测试工作的成果基础上[19-20]，尝试利用RAD新骨架进行多肽嫁接，获得了具有较高抗原亲和力的RAD嫁接类抗体分子。RAD嫁接类抗体蛋白在大肠杆菌中的表达较好，且高度可溶，并显示出了较高的生化稳定性，基本继承了原蛋白骨架优良的生化性能，也充分说明了RAD骨架的高度稳定性[9]。与前期研究工作相符，RAD骨架的DNA结合L2环状结构可以容忍序列多样性，其置换甚至删除均不影响蛋白质的稳定性。我们测定了不同条件下RAD嫁接类抗体的稳定性，最终发现RAD嫁接类抗体蛋白的稳定性未受到干扰[21]。RAD蛋白骨架的稳定性为插入多肽片段维持较恒定的空间构象提供了一定保障，可能是其抗原结合活性得以提高的主要因素。

在本项研究中，我们比较了RAD嫁接类抗体与应用单域抗体通用骨架的嫁接抗体 (CDR1嫁接抗体和CDR3嫁接抗体) 结合hCG抗原的活性情况，发现RAD嫁接类抗体展示了更好的抗原结合活性。类抗体分子的抗原结合活性主要取决于所接入的多肽片段，本研究所挑选的hCG结合多肽对hCG抗原具有较高的结合特异性，但与LH存在一定的交叉结合活性，为了提高其对hCG抗原的特异结合活性，可通过进行结合多肽的扫描突变等方法进行尝试。

本研究建立了一个新的嫁接类抗体制备体系，并成功制备了hCG的类抗体，有望应用于临床检验hCG水平，用于早期妊娠或肿瘤检测。