流感嗜血杆菌快速检测胶体金试纸的研制

陶冶，郝惠文，李杰，王猛，王毅,2,3，张改平，胡征,2,3

1 湖北工业大学 生物工程与食品学院，湖北 武汉 430068

2 发酵工程教育部重点实验室 (湖北工业大学)，湖北 武汉 430068

3 工业发酵湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430068

4 河南农业大学，河南 郑州 450002

流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae，简写H.influenzae)是一种革兰氏阴性杆菌，是感染人类的一种重要的呼吸道病原微生物，根据有无荚膜可将其分类为荚膜型和无荚膜型，其中荚膜型又可分为a-f 6个血清型，无荚膜型只有一种不可分型流感嗜血杆菌，其中b型流感嗜血杆菌 (Hib)是5岁以下儿童细菌性脑膜炎和其他侵入细菌性疾病的主要原因[1]。目前世界范围内开展的H.influenzae血清学检查大多也只针对侵袭力较强的荚膜b型。而由于该型菌株荚膜多糖疫苗的成功研发与应用，其流行已被有效控制。近年来研究显示，不可分型流感嗜血杆菌 (NTHi) 是目前引起多种上呼吸道疾病和下呼吸道疾病的主要致病菌之一[2]，能引起包括急性中耳炎[3]、肺炎、支气管炎[4]、慢性阻塞性肺疾病和结膜炎[5]等疾病。此外，NTHi的发病率正逐年增加，其临床分离率已达50%以上[6]。因此对这两种H.influenzae菌株同时进行快速、准确的检测，在感染早期进行诊断干预更具临床意义。

目前常见的H.influenzae检测方法主要有3类：血清学检测法[7]、核酸检测法[8]和病原体直接检测法[9]。其中血清学检测法检测标的物为抗荚膜抗体，无法检测出没有荚膜的NTHi；核酸检测需要特殊试剂及设备；病原体直接检测法操作复杂、培养时间长。因此这3类方法难以满足临床快速简便精准检测需求。为了解决H.influenzae的检测，急需建立一种高灵敏度和高特异性的检测方法。胶体金免疫层析试纸快速检测技术具有快速、灵敏、简便、特异、无需特殊设备及试剂、结果判定直观等优点，目前已得到广泛应用[10]。本研究根据胶体金免疫层析原理，基于针对流感嗜血杆菌特异性的表面蛋白胞外暴露区的高亲和力抗体，建立了一套H.influenzae的快速检测方法，为呼吸道感染的临床快速检测提供了初步的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及质粒

重组工程菌pET-28a(+)-P6，由本实验室赵可胜构建；感受态细胞大肠杆菌Escherichia coliRosetta购自TaKaRa公司。流感嗜血杆菌标准菌株 (ATCC 49247) 及本实验涉及到的4种病原菌株肺炎链球菌 (Streptococcus pneumoniae，ATCC 25238)、嗜肺军团菌 (Legionella pneumophila，ATCC 33152)、肺炎支原体 (Mycoplasma pneumoniae，ATCC 15531)、卡他莫拉菌 (Moraxella catarrhalis，ATCC 49619) 均购自美国菌种保藏中心；金黄色(Staphylococcus aureus) 葡萄球菌由本实验室分离鉴定；其他病原菌株：肺炎克雷伯菌 (Klebsiella pneumonia)、产酸克雷伯菌 (Klebsiella oxytosus)、鲍曼不动杆菌 (Acinetobacter baumannii)、铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) 均由湖北省武警总医院提供。

1.1.2 主要设备、试剂及层析试纸条耗材

无标记分子相互作用仪购自ForteBio公司；IPTG、BSA购自Biosharp公司；二水合柠檬酸钠购自国药集团化学试剂有限公司；四水合氯金酸购自Sigma公司；羊抗兔IgG购自武汉飞羿科技有限公司；硝酸纤维素膜 (CN140) 购自Sartorius公司；玻璃纤维膜 (CB08)、吸水纸 (CH37K)、PVC板 (SM31-40) 购自上海良信科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人流感嗜血杆菌P6抗原的制备

流感嗜血杆菌P6蛋白胞外结构域单一线性表位抗原的制备：经生物信息学分析 (表面可及性预测及线性表位预测均由武汉百意欣生物技术有限公司提供技术服务)，选定人流感嗜血杆菌P6蛋白 (GenBank登录号：AGH02799.1) V62-E75位的14个氨基酸组成的短肽作为制备兔抗人流感嗜血杆菌P6蛋白的线性抗原表位，该段氨基酸序列为VLVEGNTDERGTPE (P6Line)。在氨基酸序列的N端添加1个半胱氨酸后，用多肽自动合成仪合成多肽并纯化，纯化后的多肽与载体蛋白KLH (Keyhole limpet hemocyanin，钥孔血蓝蛋白)偶联，形成P6Line-KLH复合蛋白。

流感嗜血杆菌P6-His融合蛋白的制备：将重组工程菌E.colipET-28a-P6接种于LB培养基，37 ℃培养至吸光度OD600=0.6，加入IPTG至终浓度为0.7 mmol/L，18 ℃、170 r/min诱导过夜，收集菌体，超声破碎后取沉淀和上清进行SDS-PAGE检测。取超声破碎上清液用0.45 μm的滤膜进行过滤后用His Trap亲和层析柱 (GE公司) 进行纯化，按照说明书分步收集洗脱液，各取10 μL进行SDS-PAGE检测。

1.2.2 抗人流感嗜血杆菌外膜蛋白P6多克隆抗体的制备和纯化

将2只新西兰大白兔分别免疫P6Line-KLH复合蛋白和P6-His融合蛋白，具体免疫方法如下：将抗原蛋白与佐剂以1∶1 (V/V) 混合，总体积0.5 mL，抗原量1 mg，使用S10高速分散器将抗原充分乳化，乳化后分别在兔腹部皮下多点注射，先后注射3次，每次间隔7-10 d，除初次免疫使用弗氏完全佐剂，后续免疫均使用弗氏不完全佐剂，第3次注射10-12 d后，分别收集、分离得到含有流感嗜血杆菌P6蛋白抗体的血清，分别记为P6蛋白胞外结构域单一线性表位抗体 (AbP6Line)和P6融合蛋白多克隆抗体 (AbP6-His)，ELISA检测血清中兔抗人流感嗜血杆菌P6蛋白抗体的效价，效价均可达到1∶512 000以上。

AbP6Line的纯化：采用GE公司的rProtein A亲和层析柱，按照其说明书收集洗脱液，以磷酸盐为缓冲体系经超滤更换缓冲液后，使用SMART-LIFESCIENCES公司的PabPur Sulfolink Beads多肽亲和层析柱，按照其说明书偶联肽链P6Line。经蛋白A亲和纯化后的抗体再次进行肽链亲和纯化，得到高纯度AbP6Line。

AbP6-His的纯化：采用GE公司的rProtein A亲和层析柱，按照其说明书收集洗脱液，以磷酸盐为缓冲体系超滤浓缩。超微量分光光度计测浓度定量，分装后贴上标签，使用离心冻干机冻至干粉状态，存于-80 ℃备用。

1.2.3 多克隆抗体效价检测及鉴定

分别以纯化的P6-His融合蛋白和P6Line-KLH为包被抗原，羊抗兔IgG-HRP为酶标二抗，用间接ELISA方法测定2种抗体的效价[11]。结果判定方法，S/N=待检样品OD450/阴性对照OD450。S/N＞2.1为阳性。以S/N＞2.1所对应的抗体最高稀释倍数作为该抗体的效价。

生物膜干涉技术 (BLI) 检测：采用无标记分子相互作用仪分别对纯化后的AbP6Line和AbP6-His抗体进行抗原抗体相互作用力检测。将两种抗体分别固化到AMC传感器上，再浸入含分析物 (P6重组抗原) 的缓冲液中进行结合，浓度梯度分别为1 000 nmol/L、500 nmol/L、250 nmol/L、125 nmol/L、61.25 nmol/L。然后浸入缓冲溶液中进行解离，并利用分子互作仪的分析软件得到动力学常数。利用GraphPad Prism 7软件对数据进行整理生成结合解离曲线。

采用Western blotting对纯化后的2种抗体进行鉴定：离心收集H.influenzae菌体，经超声破碎、离心，分别收集菌体上清和沉淀进行SDS-PAGE，得到H.influenzae菌体超声破碎上清和沉淀蛋白条带，转至PVDF膜，将制备的2种多克隆抗体分别作为一抗孵育，以HRP标记的羊抗兔为二抗，通过ECL化学发光进行显影。

1.2.4 免疫层析试纸条的制备

胶体金结合垫的制备：采用柠檬酸钠还原法[10]制备40 nm的胶体金颗粒。取1 mL制备好的胶体金加2 μL的0.2 mol/L K2CO3调pH至8.0，1 mL胶体金标记4 μg AbP6Line，标记好后离心重悬至100 μL，以8 μL/cm喷涂于玻璃纤维膜上，37 ℃鼓风干燥箱放置1 h以上。

检测线和质控线的包被：将P6融合蛋白多克隆抗体和羊抗兔IgG分别稀释至2 mg/mL和1 mg/mL，以1 μL/cm通过喷金划膜仪在硝酸纤维素膜上划线，分别作为检测线 (T线) 和质控线(C线)，37 ℃鼓风干燥箱放置12 h以上。

免疫层析试纸条的组装：将样品垫、结合垫、吸水纸依次贴在PVC底板上，用斩切机将试纸切割成0.4 cm的试纸条，然后与干燥剂封装在铝箔袋内。

1.2.5 测试方法与判定标准

将待检样品溶于生理盐水 (0.85% NaCl溶液)，取150 μL滴在样品垫上，层析15 min后判断结果。若C线和T线均出现条带，则结果为阳性，若C线有条带且T线无条带，则结果为阴性，若C线和T线均无条带，说明试纸条失效，结果无效。

1.2.6 试纸条的质量测试

特异性测试：用试纸条分别检测流感嗜血杆菌H.influenzae、肺炎链球菌S.pneumoniae、嗜肺军团菌L.pneumophila、肺炎支原体M.pneumonia、卡他莫拉菌M.catarrhalis、金黄色葡萄球菌S.aureus、肺炎克雷伯菌K.pneumoniae、产酸克雷伯菌K.oxytoca、鲍曼不动杆菌A.baumannii、铜绿假单胞菌P.aeruginosa十种呼吸道常见病原菌稀释液 (10 mmol/L PBS将菌体浓度稀释至1×108CFU/mL)，鉴定试纸条的特异性。

灵敏性测试：将流感嗜血杆菌用10 mmol/L PBS分别稀释至1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104CFU/mL，以能观察到阳性结果的最低菌浓度为试纸条的检测极限。

稳定性和重复性测试：将3个不同批次的试纸条置于25 ℃储存6个月，每隔30 d用阳性样本和阴性样本进行检测，且每个样本检测3次以观察重复性。

1.2.7 试纸条的初步临床应用

用所制备的流感嗜血杆菌的胶体金试纸条对采集的湖北省中西医结合医院的200份病人咽拭子样品进行检测，同时用平板培养法做平行试验，比较两者的符合率情况，评价该方法的临床应用价值。

2 结果与分析

2.1 重组P6抗原的制备和纯化

重组工程菌经IPTG诱导表达，取表达前菌液、表达后菌液、表达后菌体超声破碎上清和沉淀进行SDS-PAGE检测，如图1所示，可看到约在分子量14 kDa处出现表达条带，与预期大小一致，表明表达产物为rP6蛋白，且部分可溶，取超破上清经镍柱亲和纯化，目标蛋白在100 mmol/L咪唑浓度的洗脱液中纯度达到90%以上 (图1)，测定浓度后离心冻干得到10 mg纯蛋白。

2.2 抗人流感嗜血杆菌外膜蛋白P6多克隆抗体的纯化

AbP6Line经A蛋白亲和纯化、肽链亲和纯化，AbP6-His经A蛋白亲和纯化分别得到AbP6Line纯抗体5.69 mg、AbP6-His纯抗体268.29 mg，纯度均达到90%以上。

2.3 抗人流感嗜血杆菌外膜蛋白P6多克隆抗体的鉴定

用间接ELISA方法测定2种抗体的效价，结果如图2所示。当用倍比稀释法将待检抗体稀释512 000倍时，AbP6Line和AbP6-His的S/N值分别为4.46、4.65，均大于2.1，则判定为阳性结果。因此两种待测抗体的效价均达到1∶512 000。

图1 P6-His融合蛋白的诱导表达及纯化结果Fig.1 Expression and purification of recombinant protein P6-His.M：protein marker;1：negative control;2：recombinant P6 expression after 4 h IPTG induction;3：supernatant collected from ultrasound disrupted E.coli;4：precipitation collected from ultrasound disrupted E.coli;5：penetrating fluid;6：eluent with 20 mmol/L imidazole;7：eluent with 40 mmol/L imidazole;8：eluent with 100 mmol/L imidazole.

图2 间接ELISA法测定抗体效价Fig.2 Determination of antibody titer by indirect ELISA.(A) P6-Line complex protein antiserum titer.(B)P6-His recombinant protein antiserum titer.

采用无标记分子相互作用仪分别对纯化后的AbP6Line和AbP6-His抗体进行抗原抗体相互作用力检测，结果见图3和表1。由曲线可看出，2种抗体分别与抗原相互作用，结果显示相互作用力均在108以上，有较好的亲和力[12]。表中KD值为解离速率常数 (kdis) 和结合速率 (kon)比值，解离速率在10-4，说明抗原抗体结合得很稳定，解离常数越小，KD越小；而KD值越小则抗原抗体的相互作用力越强；R2＞0.9，说明拟合曲线与实际曲线拟合度高，数据更有说服性；由此可得2种抗体均有较好的亲和力。

Western blotting鉴定AbP6Line结果见图4，泳道1和泳道2在17 kDa以下均出现一条清晰条带，与Hi天然表面蛋白P6的分子量 (约16 kDa)吻合，且没有其他杂带，表明AbP6Line能够高特异性识别天然Hi抗原。

图3 生物膜干涉技术 (BLI) 检测抗体亲和力Fig.3 Detection of antibody affinity by Bio-layer interference (BLI).(A) AbP6Line binding and dissociation curves.(B) AbP6-His binding and dissociation curves.

表1 生物膜干涉技术 (BLI) 检测数据结果Table 1 Data results of Bio-layer interference (BLI) test

图4 Western blotting鉴定AbP6LineFig.4 Identification of AbP6Line by Western blotting.M：protein marker;1：supernatant of H. influenzae after ultrasonication;2：recipitation of H. influenzae after ultrasonication.

Western blotting鉴定AbP6-His结果见图5，泳道1、2、3在17 kDa以下出现条带，根据分子量大小确定泳道1中条带为rP6-His重组蛋白 (约14 kDa)，泳道2、3中为Hi天然P6蛋白 (约16 kDa)，表明AbP6-His能够识别天然Hi抗原。

2.4 特异性测试

检测流感嗜血杆菌的试纸条，C线和T线均出现条带，结果为阳性；其他呼吸道常见病原菌，如肺炎链球菌S.pneumoniae、嗜肺军团菌L.pneumophila、肺炎支原体M.pneumonia、卡他莫拉菌M.catarrhalis、金黄色葡萄球菌S.aureus、肺炎克雷伯菌K.pneumoniae、产酸克雷伯菌K.oxytoca、鲍曼不动杆菌A.baumannii、铜绿假单胞菌P.aeruginosa检测结果均为阴性 (图6)，说明制备的流感嗜血杆菌检测试纸条具有较高的特异性。

图5 Western blotting鉴定AbP6-HisFig.5 Identification of AbP6-His by Western blotting.M：protein marker;1：recombinant proteinP6-His;2：supernatant of H. influenzae after ultrasonication;3：precipitation of H. influenzae after ultrasonication.

图6 流感嗜血杆菌胶体金免疫层析试纸条的特异性检测Fig.6 Specificity test of H. influenzae colloidal gold immunochromatography strip.

2.5 灵敏性测试

当样本中菌浓度稀释至1×105CFU/mL时，T线上出现一条较弱的红带，继续稀释样本进行检测，仅在C线上出现红带，说明在流感嗜血杆菌的连续稀释液中，试纸条的检出限为1×105CFU/mL，结果见图7。

2.6 稳定性和重复性测试

将试纸条置于25 ℃储存6个月后取出，对流感嗜血杆菌进行检测，其特异性和灵敏性都没有发生明显变化，且平行实验结果稳定。

2.7 初步临床应用检测结果

2017年11月至2018年2月对湖北省中西医结合医院呼吸内科所采集的200份病人咽拭子临床样品，如表2，采用所制备的流感嗜血杆菌胶体金试纸条进行检测，结果检出57份阳性样品，平板培养法检出的阳性样品为63份，二者阳性符合率为90.5%。

3 讨论

图7 流感嗜血杆菌胶体金免疫层析试纸条的灵敏度检测Fig.7 Sensitive test of H. influenzae colloidal gold immunochromatography strip.1-6：represents the concentration of H. influenzae：1×109 CFU/mL,1×108 CFU/mL,1×107 CFU/mL,1×106 CFU/mL,1×105 CFU/mL,1×104 CFU/mL;7：negative control.

表2 流感嗜血杆菌胶体金免疫层析试纸条的初步临床检测结果Table 2 Preliminary clinical test results of Haemophilus influenzae colloidal gold immunochromatographic test strip

流感嗜血杆菌是一种可引起人类严重呼吸道疾病的病原微生物，其主要致病型为Hib和NTHi[13]。因此，开发用于有效检测两种不同流感嗜血杆菌菌株的方法十分重要。研究发现，P6蛋白是一种肽聚糖偶联的脂蛋白，在所有H.influenzae菌株间均有表达，其具有种属特异性、广谱表达性和充分的表面暴露性[14]，且在一些临床样本中P6蛋白序列或基因序列都具有高度保守性[15-16]，因此本研究确定以P6蛋白作为H.influenzae的检测标的物。

在本研究中，通过生物信息学方法预测P6蛋白胞外结构域单一线性表位抗原决定簇，选定一条由14个氨基酸序列组成的短肽作为线性表位抗原，免疫得到兔抗血清，经A蛋白亲和纯化、免疫亲和纯化得到纯抗体，间接ELISA测定效价均达到1∶512 000，且通过生物膜干涉技术 (BLI)验证均有较高亲和力，同时Western blotting鉴定其与天然H.influenzae抗原结合特异性强，条带单一，达到单克隆抗体的效果。将AbP6Line作为金标抗体、AbP6-His作为捕获抗体，形成双抗体夹心，制备免疫层析检测试纸条，具有良好的灵敏度和特异性，此外，用本实验所制备的流感嗜血杆菌胶体金试纸条和平板培养法同时对200份临床样品进行检测，结果两者阳性符合率为90.5%。本研究建立的双抗夹心免疫层析法可在15 min内得到准确结果，相较于其他传统检测流感嗜血杆菌的方法，具有快速、简便、特异、灵敏的特点，不需要专业人员的培训和昂贵的仪器设备，可进行床旁检测，尤其适用于医院对吸道感染病人的实时诊断，有助于精准检测及精准治疗，有利于解决抗生素滥用等问题，具有广阔的应用前景。