猪miR-331-3p过表达载体的构建及其对细胞增殖的影响

陈涛，马立霞，崔景香，耿进红，曾勇庆，陈伟

1 山东农业大学 动物科技学院，山东 泰安 271018

2 山东农业大学 山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室，山东 泰安 271018

3 潍坊科技学院，山东 潍坊 262700

miRNA是长度为18–24 nt的短序列的单链非编码RNA，在进化上具有高度的保守性，主要通过调控基因表达的水平起作用。许多研究已表明，miRNA主要通过与靶基因的3ʹ UTR互补配对，引起靶基因mRNA的降解或者抑制其翻译[1]，实现对基因表达水平的调控，从而参与细胞的增殖、分化、凋亡和代谢等许多生物学过程[2-3]。

miR-331-3p是一种在各种物种中高度保守的miRNA，目前研究发现miR-331-3p在癌细胞的增殖分化以及癌症的发生、发展中发挥着重要作用[4]，在功能上具有多种作用。miR-331-3p可以靶向作用于细胞周期相关基因E2F1(E2F transcription factor 1)，具有抑制胃癌细胞生长和克隆的形成的能力[5]。研究发现，miR-331-3p的受体lncRNA-HOTAIR参与调节人表皮生长因子受体 2 (Glutamyl-tRNA (Gln) amidotransferase subunit HER2，HER2)的去阻遏，并强化额外水平的转录后调控可降低HER2蛋白的表达，进而降低胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭[6]。ING5是一个肿瘤抑制基因，抑制细胞生长并且诱导细胞凋亡。miR-331-3p能够通过抑制ING5表达促进肝癌(HCC) 细胞的增殖[7]。综上所述，miR-331-3p一直被认为是一种肿瘤相关因子，本身的作用也具有多样性，但这些研究都仅限于人类的癌症细胞中，miR-331-3p对于其他物种或细胞的作用研究很少。

猪是人类重要的肉食来源，其自身生长受多种因素的影响。miRNA作为目前较热门的研究领域，已经有很多研究表明miRNA在猪生长发育过程中发挥着重要的作用，例如miR-1、miR-133和miR-206都是肌肉特异性的miRNA，在肌肉形成过程中起着关键作用[8]，但是miR-331-3p在猪细胞增殖方面的研究鲜有报道。猪肾上皮细胞系即PK15细胞，是一种常见的细胞系，对于猪圆环病毒 (PCV)、猪细小病毒 (PPV) 和猪瘟病毒(CSFV) 等多种病毒比较敏感，现已广泛应用于猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒等的分离、体外培养以及相关疫苗的生产中，具有非常重要的作用[9]。因此，本研究选取PK15细胞作为研究对象，通过研究miR-331-3p对PK15细胞增殖的影响，为进一步探讨miR-331-3p在猪生长发育中的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料及主要试剂

猪肾上皮细胞 (PK15)、pcDNA 3.1(+) 哺乳动物表达载体均由实验室保存。莱芜猪耳组织采于莱芜猪原种场；DMEM培养基、Opti-MEM无血清培养基、PBS、0.25%胰酶、胎牛血清 (Fetal bovine serum，FBS) 均购于Gibco公司 (美国)；青链霉素混合液购于北京索莱宝科技有限公司(中国北京)；反转录和荧光定量试剂购于TaKaRa(中国大连)。CCK-8试剂盒购于碧云天生物技术有限公司 (中国上海)；微量RNA提取试剂盒购于Omega Bio-Tek (美国)；细胞周期与凋亡检测试剂盒购于碧云天生物技术有限公司 (中国上海)；miR-331-3p inhibitor和miR-331-3p NC购于上海吉玛制药技术有限公司 (中国上海)；T4 DNA连接酶、KpnⅠ内切酶和XbaⅠ内切酶均购于Thermo Scientific (美国)；DNA提取试剂盒、质粒大提试剂盒和普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购于天根生化科技有限公司 (中国北京)；转染试剂Lipofectamine®3000购于Invitrogen (美国)；实验所用引物合成以及测序均由生工生物工程 (上海) 股份有限公司完成。实验地点为山东农业大学动物育种学研究室。

1.2 培养基的配制

10%完全培养基：10%胎牛血清+100 IU/mL青链霉素+DMEM。5%完全培养基：5%胎牛血清+100 IU/mL青链霉素+DMEM。无双抗培养基：10%胎牛血清+DMEM。

1.3 方法

1.3.1 miR-331-3p过表达载体的构建

首先利用Primer 5.0设计包含miR-331-3p前体序列的上下游引物，分别在其5ʹ端添加KpnⅠ内切酶和XbaⅠ内切酶的酶切位点以及2 bp的保护碱基AA (表1)[10]。然后提取莱芜猪耳组织的基因组，以DNA为模板通过普通PCR扩增的方式获得目的片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，经纯化回收。最后将目的片段和载体同时酶切、琼脂糖凝胶电泳分离、纯化回收、T4 DNA酶连接构建到pcDNA 3.1(+) 载体上。

1.3.2 细胞培养

PK15细胞培养使用完全培养基，培养在CO2培养箱中，培养条件为5% CO2、37 ℃。当细胞密度大于80%，换用无双抗培养基进行实验。该实验所用的所有细胞均处于对数生长期，细胞活性大于95%。

1.3.3 细胞转染

将细胞接种到培养板上，生长到一定密度时，换用无双抗培养基继续培养。将实验分为4组：1) 实验组：转染pcDNA3.1(+)-miR-331-3p载体；2) 实验对照组：转染pcDNA3.1(+)载体；3) 抑制剂组：转染miR-331-3p inhibitor；4) 抑制剂对照组：转染miR-331-3p NC。转染步骤按照Lipofectamine®3000说明书操作，转染4 h更换新的无双抗的培养基，24 h后更换完全培养基继续培养，48 h后收集细胞。

1.3.4 绘制细胞生长曲线

将生长良好的PK15细胞1×104/mL的密度接种到96孔板，每孔加入100 μL 5%完全培养基。分别在第0 h、24 h、48 h、72 h和96 h，每孔加入10 μL CCK8试剂，37 ℃培养2 h，然后用酶标仪 (Promega，美国) 检测细胞在450 nm下的OD值，计算平均值，并绘制实验组、实验对照组、抑制剂组和抑制剂对照组的生长曲线。

1.3.5 细胞RNA提取及荧光定量PCR

将PK15细胞接种到6孔板，待细胞汇合度达到80%时转染细胞，48 h后提取细胞总RNA，然后反转录为cDNA。利用Primier 5.0设计CDK2、CDK3、CDK4、Cyclin B、ING5、CDKN1A和GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 基因的荧光定量引物 (表1)，其中GAPDH持家基因作为内参[11]。利用LightCycler®96实时荧光定量PCR系统，检测过表达miR-331-3p后细胞周期相关基因的表达情况，其定量结果通过2-ΔΔCt的方法计算。反应体系 (20 μL) 为：2× TB Green Premix ExTaq10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 7.2 μL。

同样，设计miR-331-3p的上游引物 (表1)，下游引物使用试剂盒内的通用下游引物，以U6作为内参基因[12]，引物使用miRNA反转录试剂盒内的U6上下游引物。同样使用LightCycler®96实时荧光定量PCR系统，检测miR-331-3p的表达变化。反应体系 (20 μL) 为：2× TB Green Premix ExTaq10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.4 μL。

表1 实验中用到的基因的引物序列Table 1 Primer sequences of genes used in this experiment

1.3.6 细胞周期检测

将细胞接种到6孔板，待细胞汇合度达到30%左右时分别转染实验组、实验对照组、抑制剂组和抑制剂对照组，当细胞密度达到80%–90%时，小心收集细胞培养液到1.5 mL离心管内备用。用胰酶消化细胞，至细胞可以被轻轻用移液管或枪头吹打下来时，加入前面收集的细胞培养液，终止胰酶消化过程，吹打下所有的贴壁细胞，并轻轻吹散细胞。再次收集到离心管内。300×g离心3 min去除培养基，再用1 mL预冷PBS洗1遍。然后进行细胞固定，加入1 mL冰浴预冷的70%乙醇中，4 ℃固定12 h，300×g离心去除70%乙醇，使用PBS再洗1遍。最后加入碘化丙啶染色液 (PI)，37 ℃避光水浴30 min，结束后锡箔纸包裹离心管放到冰盒上，经0.75 μm滤膜过滤后使用BD FACSCalibur流式细胞仪上机检测细胞所处周期的比例[13]。

1.3.7 实验设计与数据处理

所有实验均设置不少于3次重复，所有数据均以平均值±标准差 (±s) 表示，采用SPSS 20统计分析软件中的One-way ANOVA进行方差分析，通过Duncan氏方法进行多重比较，显著性水平定为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 miR-331-3p过表达载体的构建

实验所克隆的miR-331-3p前体大小为558 bp，并且以其为模板进行菌液PCR后经琼脂糖凝胶电泳检测，发现扩增的目的片段与预期大小一致，且条带单一、无杂带 (图1A)。提取质粒经测序比对，结果与预期相符，无杂峰干扰 (图1B)，所提取的质粒经核酸蛋白浓度测定仪检测质粒浓度高、质量好，可用于细胞转染实验。

2.2 miR-331-3p对细胞生长曲线的影响

经检测发现，4组细胞的生长曲线均呈S型 (图2)，符合体外细胞培养的生长特点。在转染24 h后，实验组细胞数显著高于实验对照组、抑制剂组和抑制剂对照组 (P<0.05)；但是实验对照组、抑制剂组与抑制剂对照组之间差异均不显著 (P>0.05)，可能是由于miR-331-3p抑制剂在24 h时作用效果不显著，导致此时miR-331-3p的表达下调不显著。在48 h和72 h时均呈现出实验组>实验对照组和抑制剂对照组>抑制剂组的趋势 (P<0.05)，在96 h时实验组、实验对照组、抑制剂组和抑制剂对照组差异已不显著。

图1 菌液PCR扩增结果和pre-miR-331-3p测序分析Fig.1 Bacterial liquid PCR and pcDNA 3.1(+)-miR-331-3p sequencing map.(A) Agarose gel electrophoresis of bacterial PCR.(B) Sequencing map of pcDNA 3.1(+)-miR-331-3p.

2.3 miR-331-3p的表达差异分析

利用qPCR方法分别检测实验组、实验对照组、抑制剂组和抑制剂对照组细胞在转染48 h后miR-331-3p的表达差异。实验组miR-331-3p的表达量显著高于实验对照组 (P<0.05)，这表明所构建的pcDNA3.1(+)-miR-331-3p载体在PK15细胞中能够发挥作用，提高了细胞自身miR-331-3p的表达水平，效果良好。相反，抑制剂组miR-331-3p的表达水平相对于抑制剂对照组显著下降 (P<0.05)，这表明miR-331-3p inhibitor确实可以达到抑制细胞本身的miR-331-3p表达的水平，符合实验要求 (图3)。

2.4 过表达miR-331-3p对细胞增殖相关基因的影响

为了探讨miR-331-3p对细胞增殖的影响，利用RT-qPCR法检测了miR-331-3p的靶基因ING5，以及周期相关基因CDK2、CDK3、CDK4、Cyclin B和CDKN1A的表达变化。结果表明，促进细胞增殖的CDK2、CDK3、CDK4和Cyclin B基因的mRNA表达趋势均为实验组>实验对照组和抑制剂对照组>抑制剂组 (P<0.05) (图4)；而具有抑制细胞增殖作用的CDKN1A和ING5基因的mRNA表达量具有相反的变化趋势，即实验组<实验对照组和抑制剂对照组<抑制剂组 (P<0.05) (图4)。

图3 miR-331-3p表达变化分析Fig.3 Analysis of expression changes of miR-331-3p.Different lower-case letters denoted significant difference (P<0.05).

图4 细胞增殖相关基因的表达变化分析Fig.4 Analysis of expression changes of cell proliferation related genes.Different lower-case letters of the same group denoted significant difference (P<0.05).

2.5 miR-331-3p对细胞周期的影响

PI染色后利用流式细胞仪检测各组PK15细胞的周期分布，得到的实验数据经ModFit软件分析后得到流式细胞图 (图5)。由图可知各组中DNA合成前期(G0/G1期)的细胞所占比例，实验组<实验对照组和抑制剂对照组<抑制剂组(P<0.05)。各组中处于DNA合成期 (S期)的细胞所占比例，实验组>实验对照组和抑制剂对照组>抑制剂组 (P<0.05)。并且各组中处于DNA合成后期和分裂期 (G2/M期) 的细胞所占的比例也是实验组>实验对照组和抑制剂对照组>抑制剂组(P<0.05)，与细胞处于S期的比例具有相同趋势。

图5 流式细胞术分析细胞所处周期Fig.5 Flow cytometric analysis of the indicated cells.Different lower-case letters of the same group denoted significant difference (P<0.05).

3 讨论

miRNA作为内源非编码短链RNA，在细胞增殖、凋亡、分化等细胞过程中发挥着重要的作用。不同的miRNA可能发挥着相同或相反的作用，甚至同种miRNA在不同的细胞中也具有不同的作用。研究表明miR-331-3p作用机制复杂，在不同的癌细胞中可能发挥着完全相反的作用机制[14-16]。

过表达miR-331-3p后相对于实验对照组和抑制剂对照组，流式细胞术结果表明G0/G1期细胞比例显著降低，抑制剂组显著升高，G0/G1期细胞所占比例降低说明细胞增殖速度加快，反之增殖速度减慢[17]。同时DNA合成期 (S期)，处于S期的细胞所占比例也显著性升高，表明过表达miR-331-3p后促使大量细胞由G1期过渡到S期，S期细胞所占比例升高，DNA、组蛋白合成速度加快，组装成染色体使细胞内染色体数目加倍为进入细胞分裂期做准备，抑制剂组结果相反。过表达miR-331-3p后在G0/G1期细胞所占比例降低S期细胞所占比例升高的基础上，DNA合成后期 (G2期) 和细胞分裂期 (M期) 细胞所占比例也显著地高于实验对照组、抑制剂组和抑制剂对照组。其中G2期是DNA复制结束与开始有丝分裂之间的间隙，在这期间细胞合成某些蛋白质和RNA分子，做好细胞进入M期的物质准备。M期为细胞分裂期，M期细胞所占比例升高直接说明了分裂期细胞增多，表明细胞生长分裂加速。所以处于G2/M期的细胞所占比例显著升高(P<0.05)，表明了细胞此时增殖能力较强能够快速大量分裂，使细胞数目增加。与其相反的是抑制剂组相对于其他分组均表现出细胞G2/M期所占比例下降，也从反面证明了这一点。因此流式细胞分析的结果表明miR-331-3p具有促进细胞增殖的效果，这与细胞增殖曲线实验组增殖速度增快，抑制剂组增殖速度减慢相符合。

细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDKs)，如CDK2、CDK3和CDK4已被公认为真核生物细胞生长和增殖的关键调控因子，这是哺乳动物细胞G1-S相变所必需的[18-19]。Cyclin B是细胞进入和退出细胞周期M期所必需的[20]。相反地，细胞CDKN1A的过度表达可能通过诱导细胞抑制细胞增殖周期阻滞，它是CDKs的抑制剂[21]。荧光定量表明实验组随着miR-331-3p表达升高显著上调CDK2、CDK3和CDK4促进细胞周期由G1期到S期的转变，促使处于S期的细胞所占比例显著上调 (P<0.05)，同时上调Cyclin B基因的表达促进细胞周期由G2期进入M期，使实验组处于G2/M期细胞的比例上调。随着miR-331-3p的高表达，细胞内的CDKN1A基因表达下调，CDKN1A具有阻滞细胞增殖的作用。其表达下调从另一个方面表明，miR-331-3p具有促进细胞增殖的作用。综合各个周期相关基因的荧光定量的表达结果说明，miR-331-3p具有促进细胞增殖的功能。有研究表明ING5为miR-331-3p的靶基因[7]，miR-331-3p的过表达和抑制表达导致ING5基因发生相应的下调和上调也证明了这一观点，因此在猪肾上皮细胞中miR-331-3p有可能是通过作用于ING5基因达到促使细胞增殖的效果。

4 结论

本研究成功构建了miR-331-3p的过表达载体，并且发现miR-331-3p可以通过促进周期相关基因CDK2、CDK3、CDK4、Cyclin B基因的表达，以及抑制ING5和CDKN1A的表达，从而促进猪肾上皮细胞增殖，这为深入研究miR-331-3p在猪生长发育中的作用机制奠定了基础。