以丙酸钙作抑菌剂制备猕猴桃酒工艺研究

周 文，舒学香，张崇军，唐贤华

（1.四川工商职业技术学院，四川 都江堰 611830；2.四川大学 轻纺与食品学院，四川 成都 610065）

猕猴桃发酵酒及其他果酒酿造过程中大多采用SO2作为抑菌剂，以防止杂菌生长从而造成发酵异常甚至产生毒素[1-4]，但SO2可能破坏人体的酶活力，影响人体新陈代谢，对肝脏造成一定的危害，SO2在酒中存在是对人体健康的一种潜在威胁，而且过量摄入会刺激呼吸道粘膜组织，进而诱发多种呼吸道炎症[5]。因此其每日允许摄入量（acceptable daily intake，ADI）为0～0.7mg/kg，我国国标GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》规定了SO2在果酒中的最高限量（≤0.25 mg/kg）[6]，然而在规定最大量的前提下，SO2在果酒中并不能充分的起到抗氧化及抗菌等作用[7-8]，所以寻找SO2的替代物是有必要的。

丙酸钙具有一定的抗菌活性[9]，是一种常用的食品添加剂，在酸性条件下能够抑制细菌和霉菌而对酵母菌无害，国标GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》中为规定其在猕猴桃酒等果酒中的用量，但规定了在酱油、醋、面包等食品中的使用量不超过2.5 g/kg[6]，ADI不作限制性规定。本课题组前期研究发现在猕猴桃果浆中添加0.6 g/L丙酸钙可以起到良好的抑菌效果，且安全性更高[10]。在此基础上，进一步进行发酵工艺条件的优化，并对其进行理化指标测定，以及通过顶空固相微萃取气质联用（headspacesolidphase microextraction-gas chromatography mass spectrometry，HSSPME-GC-MS）和香气成分分析评价，以获得一种风味优良且对人体危害小的猕猴桃发酵酒非常有必要。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红阳猕猴桃（都江堰）：市售；丙酸钙（食品级）：泰州市味香源食品添加剂有限公司；安琪葡萄酒高活性干酵母BV818：安琪酵母股份有限公司；偏重亚硫酸氢钾、碳酸钙（分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；果胶酶、明胶（生化试剂）：成都市科龙化工试剂厂。

1.2 仪器与设备

DHP-9162型电热恒温培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司；GCMS-QP2010型气相色谱质谱联用仪、Essentia LC-16型液相色谱仪：日本岛津公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS型固相微萃取头：美国Supelco公司。

1.3 实验方法

1.3.1 猕猴桃酒制备工艺

猕猴桃浆果→分选→清洗去皮→打浆→添加果胶酶→添加抑菌剂→调整pH→接种酵母→前发酵→倒罐→后发酵→澄清→降酸→陈酿→过滤→猕猴桃酒

添加果胶酶：猕猴桃果浆初始糖度16.5°Bx，初始pH 3.47；果胶酶添加量100 mg/L，于40℃恒温处理1 d；

添加抑菌剂：以丙酸钙为抑菌剂添加量为0.6 g/L，以SO2（偏重亚硫酸氢钾按50%SO2当量计）[11]为抑菌剂添加量为80 mg/L；

干酵母活化：活性干酵母中加入10倍含4%蔗糖的38℃温水，活化30 min；

前发酵：接种后发酵至猕猴桃浆糖度5°Bx，结束前发酵进行转罐后发酵；

后发酵：后发酵温度15℃，时间15 d；

澄清：按30 mg/L的量向猕猴桃原酒中加入明胶；

降酸：用碳酸钙降酸至5～6 g/L（酒石酸计）；

陈酿、过滤：4℃陈酿30 d，过滤后得猕猴桃酒成品。

1.3.2 发酵工艺优化

（1）单因素试验

主发酵温度优化：调整猕猴桃果浆pH至3.5，接种量0.08%，分别于18℃、20℃、22℃、24℃、26℃培养箱中进行主发酵，对制得的猕猴桃酒分别进行感官评分。

初始pH值优化：接种量0.08%，用柠檬酸或碳酸钙分别调整初始pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，于24 ℃培养箱中进行主发酵，对制得的猕猴桃酒分别进行感官评分。

主发酵接种量优化：调整猕猴桃果浆pH至3.5，分别调整接种量为0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%，于24℃培养箱中进行主发酵，对制得的猕猴桃酒分别进行感官评分。

（2）响应面分析

在单因素试验的基础上，以感官评分为评价指标进行研究和分析，并确定3因素3水平的最佳参数进行响应面分析，各因素及水平编码见表1。

表1 猕猴桃酒制备工艺优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for kiwi fruit wine production technology optimization

1.3.3 感官评分标准

感官评分由5名专业人员按照表2中的评分标准进行，满分100分，每个酒样得分取5人平均值。感官评价方法参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行[12]。

表2 猕猴桃酒的感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards of kiwi fruit wine

1.3.4 理化指标检测方法

酒精度、总糖、总酸、SO2含量[12]测定：参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行测定。

丙酸钙含量测定[13]：参照GB 5009.120—2016《食品中丙酸钠、丙酸钙的测定》，采用液相色谱法测定。

1.3.5 HS-SPME-GC-MS条件[14-16]

样品处理：取样前先将萃取头插入气相色谱质谱联用仪（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）进样口，250℃老化2 h。将猕猴桃酒样吸取5 mL装入15 mL顶空瓶中，并迅速加入1.0 g NaCl，加盖密封，置于40℃水浴锅中平衡20 min。将老化好的萃取针插入顶空瓶，40℃水浴中萃取40 min后插入GC-MS进样口，于250℃解吸5 min。

色谱条件：色谱柱KB-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度250℃；程序升温：初始温度40℃保持2 min，以2℃/min的速率升温至80℃后，以5℃/min的速率升温至150℃后，再以10℃/min的速率升温至250℃，保持5 min；以氦气为载气，流速1 mL/min，分流比1∶7。

质谱条件：电子轰击离子源；离子源温度280℃；电子能量70 eV；扫描范围：30～450 u。

数据处理：采集到的质谱图利用NIST08谱库进行检索，对各色谱峰按面积归一化法进行相对定量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

根据试验设计分别进行了发酵温度、初始pH值、接种量对主发酵影响的单因素试验，其结果分别如图1～图3所示。

由图1可知，随着发酵温度的升高，猕猴桃酒的感官质量随之提升，当温度升至24℃时猕猴桃酒的质量最好，当温度达到26℃时酒质又有所下降。其主要原因在于，当发酵温度偏低时，酵母菌繁殖速度较慢，主发酵启发时间延长，从而导致发酵时间延长，染杂菌机会增加，使猕猴桃酒发霉或酸度明显增加。当温度超过24℃时，由于酵母增殖快，导致衰亡速度增加，发酵中止快产酸增加[11]，同时高级醇等副产物增多，导致酒质下降。

图1 发酵温度对猕猴桃酒质量的影响Fig.1 Effect of main fermentation temperature on the quality of kiwi fruit wine

图2 初始pH值对猕猴桃酒质量的影响Fig.2 Effect of initial pH on the quality of kiwi fruit wine

图3 接种量对猕猴桃酒质量的影响Fig.3 Effect of inoculum on the quality of kiwi fruit wine

由图2可知，初始pH值为3.5时发酵所得猕猴桃酒品质最佳，当初始pH值低于3.5时酵母菌的发酵作用受到了一定的抑制，且因为调酸加入了一定量的柠檬酸导致猕猴桃酒的酸度增加，口感变差。当初始pH值超过3.5时，随着初始pH值的升高猕猴桃酒品质大幅下降，其主要原因在于，随着初始pH值的升高丙酸钙的抑菌效果急剧下降，在酸性条件下丙酸钙游离产生的丙酸分子可穿透霉菌的细胞壁，抑制细胞内酶的活性，从而阻碍霉菌等杂菌的增殖[17]，初始pH值越低产生的丙酸分子越多，抑菌效果越好。当初始pH值达到5.0时可看到猕猴桃酒大量发霉。

由图3可知，当接种量＜0.08%时，随着接种量增加猕猴桃酒的品质逐渐变好，主要原因在于当接种量较低时，发酵初始阶段酵母菌没有占据发酵优势，导致杂菌的生长，酒的品质变差。当接种量＞0.08%以后猕猴桃酒的质量趋于平稳且略有下降，其原因是接种量增大，发酵后期酵母死亡自溶增加，给猕猴桃酒带来了一定的酵母味。

2.2 Box-Behnken响应面试验

利用Deign-Expert8.0.6软件进行了响应面试验分析设计，其设计方案及结果如表3所示，回归模型方差分析见表4。通过软件对表3进行回归拟合得到感官评分（R）与影响发酵3因素发酵温度（X）、初始pH值（Y）、接种量（Z）的回归方程：

R=90.8-0.063X-0.19Y+1.38Z-0.62XY-4.96X2-3.21Y2-1.59Z2

表3 猕猴桃酒发酵工艺优化Box-Behnken试验结果与分析Table 3 Results and analysis of Box-Behnken experiments for fermentation technology optimization of kiwi fruit wine

通过软件对模型进行方差分析及回归系数显著性检验，其结果如表4所示。由表4可知通过响应面优化后得到的模型极显著（P＜0.01），说明该模型可信。失拟项P=0.1985，影响不显著（P＞0.05），复相关系数R2=0.980 6，仅有0.01%不能由该模型解释，信噪比16.148＞4。综合以上分析，可知该模型能够很好的拟合试验结果[18-20]。由表4可以看出，一次项中X（发酵温度）、Y（初始pH）影响不显著（P＞0.05），Z（接种量）影响极显著（P＜0.01）；二次项X2、Y2、Z2均极显著（P＜0.01）；交互项XY、XZ、YZ均不显著（P＞0.05），说明影响发酵工艺的3个因素之间没有明显的交互作用。通过F值推断试验范围内各因素对试验结果影响的重要性，可知各因素对感官评价影响的主次顺序是接种量＞发酵温度＞初始pH。

借助Design-Expert 8.0.6软件获得主发酵温度、初始pH和接种量对感官评分影响的三维响应面曲线，结果见图4。根据软件分析，可以得出以丙酸钙作为抑菌剂制备猕猴桃发酵酒的最优工艺条件为发酵温度23.99℃，初始pH3.49，接种量0.09%，在此条件下制备的猕猴桃发酵酒感官评分预测值为91.1。

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

图4 初始pH值、接种量以及发酵温度交互作用对感官评分影响的响应面与等高线Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of initial pH,inoculum and fermentation temperature on sensory score

2.3 响应面验证试验及理化指标分析

根据实际操作条件，将发酵条件调整为主发酵温度24℃，初始pH3.5，接种量0.09%，在此条件下以丙酸钙为抑菌剂（A）进行验证试验，同时对该条件下制得的猕猴桃酒进行了理化指标分析，并与同样条件下以SO2为抑菌剂（B）制得的猕猴桃酒进行了对比分析，其结果如表5所示。

表5 最适条件下制得猕猴桃酒的理化指标分析Table 5 Physicochemical indexes analysis of kiwi fruit wine produced under optimal conditions

从表5可以看出，分别以丙酸钙和SO2作为抑菌剂制得的猕猴桃酒具有相似的感官评分，且酒精度、总糖、总酸三个主要理化指标检测结果相近。说明丙酸钙可以替代传统猕猴桃酒生产中使用的抑菌剂SO2，制得了猕猴桃酒具有相近的感官和理化性质，为猕猴桃酒的生产提供了一种新的方法和思路。以丙酸钙为抑菌剂制得的猕猴桃酒中丙酸钙含量为1.625g/kg，符合我国食品添加剂使用标准[6]中的要求。

2.4 香气成分分析

采用顶空固相微萃取-气相-质谱联用技术（HS-SPMEGC-MS）分别对以丙酸钙和SO2作为抑菌剂制得的猕猴桃酒进行香气成分分析，其总离子流色谱图如图5所示。

从图5可以看出，不同的猕猴桃酒挥发性风味成分的GC-MS总离子图谱极其相似，香气成分的出峰时间几乎完全相同，说明两种猕猴桃酒的挥发性风味成分组成差异不大，由此表明使用不同的抑菌剂对猕猴桃酒挥发性风味成分组成影响不大。采用面积归一化法，对检测到的主要香气成分对应峰进行定量分析，其结果如表6所示。

图5 不同抑菌剂制得猕猴桃酒的香气成分的GC-MS总离子流图Fig.5 Total ions chromatogram of aroma components of kiwi fruit wine produced by different bacteriostats by GC-MS

表6 不同抑菌剂制得猕猴桃酒的香气成分对照Table 6 Comparison of aroma components of kiwi fruit wine produced by different bacteriostats

从表6可以看出，两种猕猴桃酒的挥发性风味成分组成类似，两者的共有成分有9种，其中以酯类物质为主，大多数酯类具有令人愉悦的香气，对构成猕猴桃酒的典型香气有重要作用[21-22]，如辛酸乙酯具有令人愉快的花果香气、杏子香气，癸酸乙酯具有葡萄的水果香气[23]。以丙酸钙为抑菌剂制备的猕猴桃酒丙酸乙酯、3-甲基丁酸、苯乙醇、苯甲酸甲酯、2-乙基苯酚、苯甲酸乙酯的含量更高一些，特别是丙酸乙酯增加较多，其主要原因在于丙酸钙溶解于酸性溶液中生成丙酸，丙酸与酵母菌发酵产生的乙醇发生酯化反应而生成大量丙酸乙酯，丙酸乙酯具有菠萝香味，可用作食品加香剂，GB 2760—2014规定为允许使用的香料，常用作于配制朗姆酒、白酒、菠萝型香精等。两种酒的挥发性风味成分含量不同，说明使用不同的抑菌剂制备猕猴桃酒对酒的风味具有一定的影响。

3 结论

通过单因素试验和响应面试验优化得出，以丙酸钙作为抑菌剂制备猕猴桃发酵酒的最优工艺条件为发酵温度24℃，初始pH值为3.5，接种量0.09%。在此优化条件下，实际验证猕猴桃发酵酒的感官评分为91.5分。

以丙酸钙为抑菌剂在最优工艺条件下制得的猕猴桃酒与以SO2为抑菌剂制得的猕猴桃酒相比较，在酒精度、总糖、总酸三个主要理化指标检测结果相近，说明丙酸钙可以替代传统猕猴桃酒生产中使用的抑菌剂SO2。通过香气成分比较发现，两种猕猴桃酒主要挥发性风味成分组成类似，由于丙酸钙的添加使猕猴桃酒中丙酸乙酯大量增加，不同抑菌剂制得猕猴桃酒的挥发性风味成分含量有差别导致风味存在一定差别。

以丙酸钙为抑菌剂制得的猕猴桃酒中丙酸钙含量为1.625 g/kg，达到了我国食品添加剂使用标准中的要求，说明用此法生产猕猴桃酒是安全可行的。