响应面法优化椰浆蛋白发酵饮料发酵工艺

蔺志颖，张博文*，李 佳

（西安源森生物科技有限公司，陕西 西安 710000）

椰浆是椰子榨汁后形成的产物，主要用作饮料或烹调的原料[1]。椰浆富含蛋白质、脂肪、矿物质、维生素等营养成分[2-4]，椰子中的脂肪46%为月桂酸，它是中链甘油三酯的主要来源，不会增加胆固醇水平、具有抗菌等生理功能[5]。鲜榨椰浆极易受到环境中微生物的污染，致使椰浆产品产气、膨胀、胀裂罐，故目前市场的椰浆产品主要有冷冻椰浆和灭菌椰浆两种[6-7]，在产品形式上较为单一。

乳酸菌作为一种常见的发酵菌种，应用在食品加工中起到改善风味，延长产品保质期和增强保健的功能[8]。乳酸食品对人体健康具有调节肠道功能、促进新陈代谢、增强免疫力等功效[9-11]。目前，被广泛应用于酸奶、发酵饮料、肉制品加工中。

近年来，全球植物蛋白市场增长迅猛，消费者对植物蛋白的需求将持续增长，植物性食品的全球需求量在2013年至2017年间增长了62%[12]。目前市场上大多数为植物蛋白饮料，而在发酵方面研究较少。国内外近些年的研究主要是以奶粉及椰浆为原料，研究发酵椰奶的工艺及发酵过程中营养成分的变化[13]。SHANA R等[14]以椰奶和牛奶混合发酵，研制出感官及性状较好的印度传统椰浆酸奶；GARDIOLA A B等[15]研究了不同乳酸菌发酵对椰浆蛋白中氨基酸含量的变化，结果表明，乳酸酸发酵提高了椰子蛋白浓缩物的赖氨酸和蛋氨酸水平。

本研究旨在以椰浆乳原料，通过乳酸菌发酵研制植物基蛋白发酵饮料，并采用单因素及响应面试验优化其发酵工艺条件，在提高椰浆的利用率的同时，丰富蛋白发酵饮料的种类，提升椰浆乳的营养价值，并为今后椰浆发酵蛋白饮料产品的产业化开发提供工艺指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

椰浆粉：海南南派实业有限公司；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、双歧杆菌（Bifidobacterium）BB-12、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热链球菌（Strep-tococcus thermophilus）菌粉：江苏微康生物科技有限公司；白砂糖（食品级）：市售；MRS肉汤培养基：北京奥博星生物技术有限责任公司；氢氧化钠、酚酞（均为分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DUP-9160B智能电热恒温培养箱：上海琅玕实验设备有限公司；BHC-1300IIA/B2无菌操作台：苏州净化设备有限公司；YXQ-LS-70A立式压力蒸汽灭菌器：上海博讯试验有限公司医疗设备厂；PHS-3C雷磁pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；SLS-60高压均质机：上海申鹿均质机有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 椰浆蛋白发酵饮料工艺流程

1.3.2 操作要点

椰浆粉按照料水比1∶4（g∶mL）加常温蒸馏水溶解，加入适量白砂糖及0.05%的稳定剂，将加入配料的原料预热60℃，采用高压均质机在15 MPa条件下进行均质，于90℃条件下杀菌15 min，冷却至45℃后，无菌条件下接种1.5‰乳酸菌菌粉（植物乳杆菌∶双歧杆菌BB-12∶保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌=1∶1∶1∶1），在温度为43 ℃条件下[16]发酵16 h，发酵结束后在4℃条件下后熟12 h。

1.3.3 椰浆蛋白发酵饮料工艺优化单因素试验

以发酵温度43℃、接种量（植物乳杆菌∶双歧杆菌BB-12∶保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌=1∶1∶1∶1）1.5‰、发酵时间16 h和白砂糖添加量4%为基础发酵条件，对接种量（0.5‰、1.0‰、1.5‰、2.0‰、2.5‰）、发酵时间（8 h、12 h、16 h、20 h、24 h）和白砂糖添加量（2%、3%、4%、5%、6%）进行单因素试验，考察接种量、发酵时间及白砂糖添加量对椰浆蛋白发酵饮料酸度及感官品质的影响。

1.3.4 响应面试验优化椰浆蛋白发酵饮料发酵工艺

在单因素的基础上，采用Box-Benhken试验设计，设置接种量（A）、发酵时间（B）和白砂糖添加量（C）3因素为自变量，以单因素结果为中心点，设3个水平，以发酵产品感官评分（Y）为响应值，进行发酵工艺优化，响应面试验因素与水平见表1。

表1 Box-Benhken试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Box-Benhken experiments design

1.3.5 分析检测

（1）总酸

按照GB 541334—2010《乳和乳制品酸度的测定》测定发酵蛋白饮料总酸。

（2）蛋白质

按照GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》测定发酵蛋白饮料蛋白质含量。

（3）感官评价

选择10人组成感官评价小组，对椰浆蛋白发酵饮料的色泽、气味、组织形态及口感进行评价，满分10分，感官评价标准见表2。

表2 椰浆蛋白发酵饮料感官评价标准Table 2 Sensory evaluation standards of coconut milk protein fermented beverage

1.3.6 数据统计与分析

试验数据采用Design Expert8.0.5进行分析处理，采用Origin 8.0软件绘图处理。每组试验3次平行，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 椰浆蛋白发酵饮料工艺优化单因素试验

2.1.1 接种量对椰浆蛋白发酵饮料的酸度和感官评价的影响

不同接种量对椰浆蛋白发酵饮料的酸度和感官评价的影响结果见图1。由图1可知，接种量为0.5‰时，发酵成熟的样品酸度仅为47.8°T左右。随着接种量在0.5‰～2.5‰范围内的增加，椰浆蛋白发酵饮料酸度呈持续上升的趋势。在接种量为1.5‰时，酸度达61.3°T；当接种量为2.5‰时，酸度达70.0°T。随着接种量在0.5‰～2.5‰范围内的增加，感官评分呈现先上升后下降的趋势。在接种量为1.5‰时，感官评分最高，达9.0分，酸度适宜。而低接种量条件下，由于菌种产酸量较低，产品酸味不明显[17]；接种量为2.5‰时，由于产酸量的增加，导致产品酸味过于明显，掩盖了本身的椰奶风味，使得在感官上接受度降低[18]，综合感官评分仅为7.1分。综合接种量对产品酸度及感官评分的影响，选择接种量为1.5‰。

图1 接种量对椰浆蛋白发酵饮料酸度及感官评价的影响Fig.1 Effects of inoculum on acidity and sensory evaluation of coconut milk protein fermented beverage

2.1.2 发酵时间对椰浆蛋白发酵饮料的酸度和感官评价的影响

不同发酵时间对椰浆蛋白发酵饮料的酸度和感官评价的影响结果见图2。由图2可知，发酵时间对酸度影响较大，随着发酵时间在8～24 h范围内的延长，菌种持续产酸，使得产品酸度呈上升趋势。发酵8 h时，酸度仅为30.1°T；而发酵24h后，酸度达67.2°T，约为发酵8 h产品酸度的2倍。随着发酵时间在8～24 h范围内的延长，感官评分呈先上升后下降的趋势。发酵时间＜12 h之前，由于乳酸积累较少，使得产品发酵酸味不明显，导致评分较低。而随着发酵的进行，乳酸积累，产品发酵酸味提升，甜酸适宜，在发酵20 h时，感官评分最高，达到8.3分。随着发酵时间的进一步延长，酸度积累过高导致风味过酸，且发酵时间过长导致乳清析出，并导致评分呈现下降趋势[19-20]。

图2 发酵时间对椰浆蛋白发酵饮料酸度及感官评价的影响Fig.2 Effects of fermentation time on acidity and sensory evaluation of coconut milk protein fermented beverage

综合发酵时间对产品酸度及感官评分的影响，选择发酵时间为20 h。

2.1.3 白砂糖添加量对椰浆蛋白发酵饮料的酸度和感官评价的影响

不同白砂糖添加量对椰浆蛋白发酵饮料的酸度和感官评价的影响结果见图3。由图3可知，白砂糖添加量对椰浆蛋白发酵饮料的酸度影响较小，发酵成熟后酸度含量差异不明显，成品酸度均在63°T左右。随着白砂糖添加量在2%～6%范围内的增加，感官评分呈先上升后下降趋势，白砂糖添加量较少时，发酵饮料酸味较明显，且风味上醋酸味明显，感官评分仅为7.1分；白砂糖添加量为4%时，感官评分最高为8.9分；白砂糖添加量＞4%之后，会影响菌种的生长，导致产品在组织形态上表现出少量乳清析出的状态，且口感过甜无法接受[21]。

图3 白砂糖添加量对椰浆蛋白发酵饮料酸度及感官评价的影响Fig.3 Effects of sugar addition on acidity and sensory evaluation of coconut milk protein fermented beverage

综合白砂糖添加量对产品酸度及感官评分的影响，选择白砂糖添加量为4%。

2.2 响应面优化椰浆蛋白发酵饮料工艺

2.2.1 回归方程建立与方差分析

根据单因素试验结果，以接种量（A）、发酵时间（B）及白砂糖添加量（C）为自变量，感官评分（Y）为因变量进行响应面试验，Box-Benhken试验设计及结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 Box-Benhken试验设计及结果Table 3 Design and results of Box-Benhken experiments

续表

采用Design Expert 8.0.5软件对表4数据进行二次回归方程拟合，得到感官评分（Y）对接种量（A）、发酵时间（B）及白砂糖添加量（C）的二次多项回归方程：

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，模型极显著（P=0.000 2＜0.01），失拟项不显著（P=0.123 4＞0.05）。回归模型的决定系数R2=0.97，说明该模型能够很好地描述试验结果。变异系数（coefficient of variation，CV）为89%，说明模型的准确度及可靠性较高[22]。从表4中P值和回归方程中各因素的一次项系数的绝对值大小可知，影响椰浆蛋白发酵饮料感官评价因素主次顺序为白砂糖添加量＞接种量＞发酵时间[23]。一次项C及交互项BC对产品感官评分的影响达到显著水平（P＜0.05），二次项A2、B2及C2对产品感官评分的影响达到极显著水平（P＜0.01）。

2.2.2 各因素响应面交互作用分析

采用Design Expert8.0.5软件对影响椰浆蛋白发酵饮料的3个因素进行交互分析，结果见图4。

图4 接种量、发酵时间和白砂糖添加量对椰浆蛋白发酵饮料感官评价影响的响应面及等高线Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between inoculum，fermentation time and sugar addition on sensory evaluation of coconut milk protein fermented beverage

由图4可知，等高线的形状反映出交互效应的强弱大小，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形则与之相反[24]。接种量固定不变，椰浆蛋白发酵饮料的感官评价随发酵时间增加，呈现先增加后减少的趋势；发酵时间不变，感官评价随乳酸菌接种量的增加先急剧增大后明显减小。乳酸菌接种量固定不变，感官评价随白砂糖添加量的增加，呈现先增加后减少的趋势；白砂糖添加量不变，椰浆蛋白发酵饮料的感官评价随接种量的增加，增大并在后面呈下降趋势。固定发酵时间，感官评分随白砂糖添加量的增加急剧增大后略有下降，白砂糖添加量不变，感官评分随发酵时间的增加，变化不明显。

2.2.3 最优发酵条件的确定及验证

根据多元二次回归方程，得到最优发酵条件为乳酸菌接种量1.00‰，白砂糖添加量3.95%，发酵时间20.5 h，得到的产品感官评分理论值为9.39分。为了便于实际操作，将发酵工艺条件修改为接种量1.00‰，白砂糖添加量4.0%，发酵时间20 h，根据此条件进行验证试验，得到的产品感官评分实际值达9.37分，酸度63°T，蛋白含量1.1 g/100 mL。其中感官评分与理论值差别不大，说明该模型能够较好地模拟和预测试验结果。

3 结论

通过单因素试验对接种量、发酵时间和白砂糖添加量进行优化，利用响应面优化椰浆蛋白发酵饮料工艺参数。最优发酵工艺条件为将乳酸菌按植物乳杆菌∶双歧杆菌BB-12∶保加利亚乳杆菌∶嗜热链球菌=1∶1∶1∶1的比例接种于添加了4.0%白砂糖的椰浆中，接种量为1.00‰，43℃条件下发酵20 h。在此发酵条件下，椰浆蛋白发酵饮料感官评分达9.37分，酸度63 °T，蛋白含量1.1 g/100 mL，符合国家农业行业标准NY/T 433—2014《绿色食品植物蛋白饮料》要求，色泽乳白，具有椰奶香味及发酵特有的风味，是一款老少咸宜的植物基蛋白发酵饮料。