由核桃疫病果实上分离的一株栖稻假单胞菌YKW14

邹路路，邢献敏，傅本重

(湖北工程学院生命科学技术学院/特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，湖北 孝感 432000)

【研究意义】核桃(Juglansregia)为胡桃科胡桃属(Juglans)高大落叶乔木，原产于中东地区，是我国重点发展的干果战略产业之一。核桃常见的病害有30余种，重要的有疫病、炭疽病和白粉病等[1-2]。【前人研究进展】核桃疫病(Walnut blight)是世界范围内核桃生产上最重要的细菌性病害，该病害于1901年由Pierce首次在美国加利福利亚州报道[3]，此后，在美国、意大利、法国、伊朗和中国都有严重的爆发[4-8]。它主要危害果实，其次是叶片、嫩梢、枝条、及花序等，一般植株病害率达70 %～90 %，果实被害率达10 %～40 %，严重时达95 %以上[8]，严重影响核桃产量和品质。Hajri等[9]发现，该病害也会引起核桃树主干和侧枝垂直溃疡并伴随有粘液渗出(vertical oozing canker，VOC)。此外，还可引起幼果褐色顶端坏死(Brown Apical Necrosis, BAN)症状，造成严重的落果[10-12]。一般认为核桃疫病的病原菌主要为树生黄单胞菌核桃致病变种(Xanthomonasarboricolapv.juglandis, Xaj)。但是，2001年Belisario 等从核桃顶端褐色坏死病病果中也分离到了镰刀菌(Fusariumspp.)等真菌，因此认为核桃顶端褐色坏死是一种复合侵染型病害[13]。2007年以来，曲文文等在山东的核桃褐色顶端坏死病果中分离出链格孢属(Alternariasp.)真菌[14]，杨克强等认为成团泛菌(Pantoeaagglomerans)也是它的病原物之一[15]。 栖稻假单胞菌Pseudomonasoryzihabitans之前称栖稻黄色单胞菌Flavimonasoryzihabitans，最初于1928年在人体尿液和胃肠道样本中鉴定出来[16]， 1985年从稻田中分离到此菌，更名为P.oryzihabitans。它是一种非发酵、氧化酶反应阴性、需氧，产黄色素的革兰氏阴性杆状细菌，可以引起败血病、腹膜炎、眼内炎和菌血症的机会主义病原菌[17-18]。2011年首次报道了9岁儿童被章鱼咬伤后，感染了栖稻假单胞菌，溃疡斑很难愈合[19]。2014年韩国报道了该菌引起的假性菌血症爆发，推测可能是装消毒纱布的罐灭菌不完全引起的[20]。从灰仓鼠中也发现了栖稻假单胞菌[21]。2016年，从人面部感染病灶上分离得到病原菌栖稻假单胞菌，它对喹诺酮类、碳青霉烯类、3代头孢菌素等抗生素敏感[22]。它在多种环境来源中都有发现，从最初的稻田土壤到昆虫和植物等来源，也可通过手术和医用导管感染人，但关于此病菌的致病性特点不是十分清楚。覃益民等从土壤中筛选得到一株产纤维素酶增效蛋白的栖稻假单胞菌POEP1[23]。张望月等用大蜡螟从菜地和林地也诱集分离得到了栖稻假单胞菌CY04[24]。随后，从小菜蛾3龄幼虫肠道也分离得到该菌[25]。有报道栖稻假单胞菌在苹果叶面也有分布[26]。对桑叶穿孔病的病原物分离鉴定，得到5种细菌43株，其中有2株为栖稻假单胞菌[27]。【本研究切入点】本文对一株分离自核桃果实疫病上的栖稻假单胞菌的生理生化和生物学特性进行了研究。【拟解决的关键问题】其可能为一种新的核桃病原菌，或在疫病的发生过程中起作用。

1 材料与方法

1.1 菌株和培养基

菌株YKW14分离自云南昆明核桃典型疫病症状的果实，保存于本实验室。马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、Luria-Bertani培养基(LB)、SOB (Super Optimal Broth)培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)、NA(Nutrient Agar)培养基[28]。

1.2 试剂

壮观霉素(Sp)、卡那霉素(Km)、氨苄青霉素钠(Amp)和头孢(Cep)购于Sigma公司。石硫合剂、稻瘟灵和戊唑醇等农药由河北冠龙农化有限公司生产。氯化钠、乙醇、盐酸、氢氧化钠、刚果红、碘、肌酸、盐酸二甲基对苯撑二胺及丙三醇等其他试剂为分析纯。

1.3 细菌在不同培养基上的生长情况

将菌株YKW14分别划线接种于PDA、SOB、LB、NA、YPD 5种不同培养基平板上。于28 ℃下培养3 d后观察其生长状况。

1.4 细菌生理生化特性、抗药性及冰核活性能力测定

根据东秀珠等编著的《常见细菌系统鉴定手册》，对菌株YKW14进行了甲基红、乙醇氧化及脲酶等21项生化指标测定[28]。配制相应浓度的含药或抗生素LB培养基平板，稻瘟灵、戊唑醇和石硫合剂为推荐使用浓度，抗生素浓度Sp(50 μg/mL)、Km(50 μg/mL)、Amp(50 μg/mL)、Cep(50 μg/mL)，再划线接种Xaj，28 ℃下培养3 d后观察，根据细菌是否生长判断其抗性。冰核活性能力测定根据文献的方法进行[29]。

1.5 细菌的分子鉴定

菌株的分子鉴定用16S rDNA和gyrB基因进行。用细菌基因组提取试剂盒(上海生工生物有限公司)提取细菌总DNA，并以此为模板，用通用引物 27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTC AG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增16S rDNA，用引物gyrB1(5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGC AYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′)和gyrB2(5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGC RTCNGTCAT-3′)扩增gyrB基因[30]。反应体系(25 μl)为：2×PCR Master Mix (上海生工生物有限公司)12.5 μl，模板DNA 1 μl，上下游引物(10 μmol/L)各1 μl，ddH2O 9.5 μl。PCR扩增反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR 产物经1.5 % 琼脂糖凝胶电泳验证后，扩增产物送往上海生工有限公司双向测序。

测序结果通过NCBI数据库在线Blast比对分析，选取同源性和一致性较高，且菌株种属明确的相应序列，用MEGA7.0软件Neighbour-Jioning法对它们进行系统发育树构建(bootstrap=1000)[31]。

图1 YKW14在5种不同的培养基上的生长状况Fig.1 The strain YKW14 growth on 5 medium

2 结果与分析

2.1 细菌在不同培养基上的生长状况

将菌株YKW14划线接种于NA、LB、SOB、PDA和YPD五种培养基平板，3 d后观察结果表明，在LB培养基平板上细菌生长浓密，长势最好。在NA、PDA和SOB 3 种培养基上细菌也可以生长，但是生长状况不如LB培养基好。而将该菌划线接种到YPD平板上，其基本上不生长(图1)。因此，后续的培养用LB培养基进行。

2.2 病原菌生理生化特性、抗药性、冰核活性等特性分析

菌株YKW14为杆状，在2 %氯化钠溶液浓度的培养液中不能生长。50 ℃处理10 min后，细菌可以继续生长，用55 ℃及更高温度处理细菌不能生长。在分别含有抗生素Sp、Km、Amp，以及稻瘟灵、石硫合剂和戊唑醇 3 种农药的培养基上实验菌都能生长，说明该菌对这些抗生素和农药都有一定的抗性。而在含有Cep的培养基上，细菌不生长，说明该菌对Cep无抗性(表1)。有许多假单胞菌有很强的冰核活性，但是该菌株未检测到冰核活性。

2.3 菌株的分子鉴定

经测序结果表明，菌株YKW14的16S rDNA序列长为1440 bp。利用NCBI数据库中的Blast程序分析结果表明，菌株与P.oryzihabitansUSDA-ARS(CP013987.1)和P.oryzihabitans16S ribosomal RNA(HM038118.1)等菌株的同源性最高，相似性达到100 %。用MEGA7.0软件，按照Neighbour-Jioning法和种属明确的7株假单胞菌，以及树生黄单胞菌核桃致病变种 NCPP411为外群，构建系统发育树(图2)。菌株gyrB测序分析表明，序列长1176 bp。Blast软件分析结果表明，其与栖稻假单胞菌和铜绿假单胞菌的同源性较高，相似性达到100 %。用同样的方法将该菌株与其他种属明确的7株菌的gyrB基因构建系统发育树(图3)。

结合菌株形态、生理生化特性以及2个保守基因的序列比较分析，将该菌株YKW14鉴定为栖稻假单胞菌Pseudomonasoryzihabitans。

3 结论与讨论

核桃疫病在果实上的症状主要有黑斑，通常是果实侧斑，在果实顶端为褐色坏死，还可能会导致树干垂直溃疡。其病原菌除了Xaj之外，有也报道其他菌可能起作用。本研究从云南昆明核桃园中核桃疫病的幼果侧黑斑上分离到一株栖稻假单胞菌，它总是与Xaj一同被分离到。经过生理生化特性和分子鉴定，其为栖稻假单胞菌P.oryzihabitans。该菌在LB平板生长较好，在2 %氯化钠浓度的培养基上不能生长，菌液在55 ℃下处理10 min后，再接种不能生长。该菌株对石硫合剂、稻瘟灵、戊唑醇有抗性；对抗生素壮观霉素、卡那霉素、氨苄青霉素钠也表现出抗性，而对头孢无抗性。菌株的抗药性特点可能是在核桃园长期用药过程中选择的结果。此前也有报道栖稻假单胞菌对氨苄青霉素、阿莫西林克拉维酸和唑啉头孢菌素等有抗性[31]。

表1 菌株YKW14生理生化特性及抗药性

注：“+”指反应呈阳性；“-”指反应呈阴性。

Note: + indicates positive; - indicates negative.

图2 基于16S-rDNA的相似菌株系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S-rDNA homologies.

图3 基于gyrB的相似菌株系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on gyrB homologies

栖稻假单胞菌P.oryzihabitans存在和来源于多种环境条件。在动物、植物和土壤环境中都有报道。本文从核桃发病果实的患病处分离到了该菌，它可能是核桃病害的一种新的病原菌，或者与其他菌一起复合侵染引起病害，其单独或在复合侵染中的致病性作用还需要进一步的确认。