甲状旁腺激素联合阿仑膦酸钠对大鼠骨质疏松性骨折骨痂血管形成的影响

刘颖 孙昌俊 王乐 毕若杰 张恒 王大璐 齐巍

唐山市第二医院，河北 唐山 063000

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨量减少、骨微结构破坏、骨脆性增加、导致骨折危险性显著升高的一种全身性骨病。骨折是OP最严重的并发症，20%的OP患者有发生骨质疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)的可能，是致残致死的主要原因之一[1]，因此，如何降低OPF的发生率已成为治疗骨质疏松的防治目的。OP不仅增加了患者发生骨折的风险，严重影响骨折愈合进程及效果[2]。随着我国人口的老龄化的加剧，OP及OPF的发病率逐渐上升，给家庭和社会带来了沉重的经济负担。甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)是目前临床治疗骨质疏松症的最常用药物之一，可调节钙、磷代谢水平。阿仑膦酸钠是首个以骨质疏松为适应证而获准上市的第三代二膦酸盐类药物，能显著增加骨量，提高骨质强度，降低骨折发生率。研究表明，甲状旁腺激素联合唑来膦酸对去势大鼠的骨折愈合有累加作用[3]。因此，本研究旨在探讨甲状旁腺激素联合阿仑膦酸钠对OPF骨痂血管形成及骨折愈合的作用机制，为临床应用治疗OPF提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与材料

75只SPF级雌性SD大鼠，12 W龄，体重(320±30)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SYXK(京)2017-0033)。重组人甲状旁腺激素(1-34)(100μg/支，批号：J201708072，美国Sigma公司)，阿仑膦酸钠片(福善美)(70 mg×1 s，生产批号：J20170085，美国默沙东制药有限公司)，柜式X线照片机购置于美国Hologic公司，双能X线骨密度测定仪购于美国GE公司，MTS-858型生物力学实验机购于美国MA公司，ELISA检测试剂盒购于武汉云克隆科技股份有限公司，兔抗鼠血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)多克隆抗体购于武汉博士德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1实验分组与药物干预：SD大鼠饲养于华北理工大学医学动物实验中心SPF级屏障环境；按随机数字法分为假手术组、去势组、甲状旁腺素组、阿仑膦酸钠组、联合用药组，假手术组仅切除部分脂肪组织，其他4组均行双侧卵巢切除术。于术后第2天分别给予不同药物干预，假手术组、去势组：皮下注射0.9% NaCl 5 mL/kg，1次/d；甲状旁腺素组：皮下注射PTH(1-34)50 μg/kg，1次/d；阿仑膦酸钠组：灌胃阿仑膦酸钠片0.5 mg/kg，1次/d；联合用药组：皮下注射PTH(1-34)50 μg/kg，1次/d，灌胃阿仑膦酸钠0.5 mg/kg，1次/d。连续用药8周。

1.2.2构建去卵巢大鼠骨质疏松骨折模型：10%水合氯醛腹腔麻醉，取腹背部中线第2腰椎做长约2 cm纵行切口，依次分离进入腹腔，沿输卵管寻找卵巢组织，严密结扎输卵管，切除卵巢，逐层间断缝合。卵巢切除术后4周行右侧股骨干骨折髓内固定术。腹腔麻醉，取左大腿外侧纵行切口，暴露股骨中段，使用线锯横行锯断股骨，用电钻以直径1.0 mm克氏针顺行插入骨折远端，骨折达到解剖复位，固定可靠且骨折端对位对线良好，逐层间断缝合，术后常规青霉素80万U肌肉注射，预防感染。各组大鼠均分笼饲养，标准饲料，自由饮水，饲养环境条件均相同。

1.2.3组织标本处理：摄片后10%水合氯醛麻醉，采取急性大失血法处死大鼠，打开胸腔，左心室采血5～10 mL，3 000 r/min，离心15 min，收取上层血清0.5～1 mL，-20 ℃保存备用。剥离股骨痂，0.9%NaCl冲洗后于10%甲醛溶液固定，10%硝酸脱钙，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制作5 μm切片，60 ℃烤箱4 h，取出室温保存备用。

1.2.4放射性(X线)检查：术后4周选取各组大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉后进行X线摄片，观察各组大鼠骨折愈合情况。放射学评估采用Warden[4]X线评分系统进行评估，依据骨折断端表现行骨折愈合评分。评分标准：没有愈合1分；骨痂形成不明显2分；骨折部分愈合3分；骨折线逐渐消失，骨痂逐渐吸收消失4分；完全愈合5分。

1.2.5骨生物力学检测：采用电子生物力学测试装置对骨折骨痂进行三点弯曲实验，仪器调试正常后固定骨标本位置，测试区域为骨痂中心位置，以支点跨距为20 mm，加载速度2 mm/min给予股骨骨痂施加压力直至骨头断裂，通过计算机记录加载位移载荷-变形曲线，计算出最大荷载(N)和抗弯强度(N/mm)。

1.2.6骨痂骨密度(bone mineral density，BMD)测定：取出待测骨痂，在LUNAR双能X线吸收扫描仪测量骨折部位上下区域骨密度，采用分辨率1.0 mm×1.0 mm，扫描速度60 mm/s的扫描模式，以骨折端2.0 mm×2.0 mm为中心区域，测量骨痂BMD(g/cm2)，连续测量BMD各5次。

1.2.7血清VEGF和BMP-2浓度测定：采用ELISA试剂盒检测血清VEGF和BMP-2浓度，按照试剂盒说明书步骤进行操作。

1.2.8HE染色：参照HE染色法实验步骤进行操作[5]，光镜下观察染色并采集图片。随机选取5个视野，计数新生血管数，取平均值。

1.2.9免疫组织化学染色法：以兔抗鼠VEGF多克隆抗体浓度(1∶1000)，参照免疫组织化学染色法实验步骤进行操作[6]。光学显微镜观察并采集图片，图像分析软件进行分析，免疫组织化学染色结果采用免疫反应评分(IRS)进行测定。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组骨折愈合及评分

假手术组骨折线模糊不清或消失，骨痂生长包绕骨折端，连接紧密；去势组骨折线依然清晰可见，未见明显骨痂生长，断端骨痂未连接，骨折愈合欠佳。甲状旁腺素组和阿仑膦酸钠组骨折线部分模糊，骨痂少量生长，骨折端骨痂部分连接，连接不紧密；联合用药组骨折线模糊，骨折端有连续性骨痂包绕，骨痂体积较大，部分愈合，并开始重建塑形。假手术组、去势组、甲状旁腺素组、阿仑膦酸钠组、联合用药组骨折愈合评分分别为：4.86±0.50、2.25±0.24、3.10±0.12、3.27±0.10、4.50±0.42。去势组较假手术组骨折愈合评分显著降低(P<0.05)，甲状旁腺素组、阿仑膦酸钠组、联合用药组较去势组骨折愈合评分均升高，其中以联合用药组骨折愈合评分升高最显著(P<0.05)。详见图1。

图1 术后4周X线情况 A：假手术组；B：去势组；C：甲状旁腺素组；D：阿仑膦酸钠组；E：联合用药组Fig.1 X-ray situation in 4 w after operation. A: Sham operation group; B: Castration group; C: Parathyroid hormone group; D: Alendronate group; E: Combination group

2.2 各组骨痂生物力学

各组大鼠股骨骨痂生物力学比较见表1。去势组较假手术组骨痂最大荷载和抗弯强度显著降低(P<0.05)，甲状旁腺素组、阿仑膦酸钠组、联合用药组较去势组骨痂最大荷载和抗弯强度均升高，其中以联合用药组骨痂最大荷载和抗弯强度升高最显著(P<0.05)。

组别例数最大荷载/N抗弯强度/(N/mm)假手术组15230.80±15.30175.64±16.20去势组15138.64±10.29※105.23±13.50※甲状旁腺素组15166.28±12.63135.64±14.06阿仑膦酸钠组15175.60±13.25128.20±11.24联合用药组15213.35±12.07#151.28±13.50#

注：与假手术组比较，※P<0.05；与去势组比较，#P<0.05。

2.3 各组骨痂BMD比较

各组大鼠股骨骨痂BMD比较见表2。去势组较假手术组骨痂BMD显著降低(P<0.05)，甲状旁腺素组、阿仑膦酸钠组、联合用药组较去势组骨痂BMD均增高，尤以联合用药组增高最显著(P<0.05)。

注：与假手术组比较，※P<0.05；与去势组比较，#P<0.05。

2.4 各组血清VEGF和BMP-2浓度比较

各组大鼠血清VEGF和BMP-2浓度比较见表3。去势组较假手术组血清VEGF和BMP-2浓度均显著降低(P<0.05)，甲状旁腺素组、阿仑膦酸钠组、联合用药组较去势组血清VEGF和BMP-2浓度均升高，其中以联合用药组血清VEGF和BMP-2浓度升高最显著(P<0.05)。

组别例数VEGF/(μg/L)BMP-2/(μg/L)假手术组152.57±0.322.94±0.50去势组151.40±0.16※1.61±0.10※甲状旁腺素组151.72±0.252.17±0.37阿仑膦酸钠组151.80±0.301.97±0.20联合用药组152.32±0.35#2.58±0.42#

注：与假手术组比较，※P<0.05；与去势组比较，#P<0.05。

2.5 各组组织学观察

假手术组骨痂骨小梁粗细均匀，生长旺盛，排列致密有序，成骨细胞数量较多，大量新生微小血管形成。去势组骨痂骨小梁明显减少，生长稀疏，排列紊乱，大量纤维组织及纤维软骨细胞。甲状旁腺素组和阿仑膦酸钠组骨痂骨小梁相对较少，仍较纤细，排列较稀疏，略不规则，成骨细胞数量相对较少，可见新生微小血管。联合用药组骨小梁粗大，生长旺盛，排列致密有序，可见较多成熟的骨细胞及成骨细胞，新生微小血管较多。详见图2。

图2 HE染色观察骨痂的形态结构变化(×200) A：假手术组；B：去势组；C：甲状旁腺素组；D：阿仑膦酸钠组；E：联合用药组Fig.2 Morphological changes of bone callus were observed under HE staining (×200). A: Sham operation group; B: Castration group; C: Parathyroid hormone group; D: Alendronate group; E: Combination group

假手术组、去势组、甲状旁腺素组、阿仑膦酸钠组、联合用药组微血管计数(个/100倍视野)分别为：3.74±0.57、1.80±0.36、2.63±0.42、2.54±0.30、3.30±0.44。去势组微血管数显著低于假手术组(P<0.05)，甲状旁腺素组、阿仑膦酸钠组、联合用药组较去势组微血管数均增多，其中以联合用药组微血管数增加最显著(P<0.05)。

2.6 各组VEGF表达

VEGF主要表达于成骨细胞内及少量成熟软骨细胞，以细胞膜或细胞质呈棕黄色为阳性。依据免疫反应评分得出假手术组、去势组、甲状旁腺组、阿仑膦酸钠组、联合用药组的VEGF表达分别为：0.271±0.035、0.143±0.010、0.1885±0.015、0.205±0.020、0.238±0.028。去势组较假手术组VEGF阳性表达显著降低(P<0.05)，甲状旁腺素组、阿仑膦酸钠组、联合用药组较去势组VEGF阳性表达均升高，其中以联合用药组VEGF阳性表达升高最显著(P<0.05)。详见图3。

图3 免疫组化观察骨痂组织VEGF表达(×200) A：假手术组；B：去势组；C：甲状旁腺素组；D：阿仑膦酸钠组；E：联合用药组Fig.3 The VEGF expression in callus was observed with immunohistochemistry (×200). A: Sham operation group; B: Castration group; C: Parathyroid hormone group; D: Alendronate group; E: Combination group

3 讨论

骨折愈合是一个复杂但有序的骨组织再生的过程，这一过程不仅由基因表达所致的新骨组织的不断合成与吸收，而且受到微环境(如细胞因子、生化因子、微血管)的影响[7]。甲状旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)是骨代谢过程中重要的调节因子，在调节机体钙磷代谢有十分重要的作用。PTH(1-34)不仅可刺激成骨细胞增殖、产生碱性磷酸酶及骨基质蛋白，促进软骨及骨形成，从而促进纤维性骨痂形成和改善骨痂的生物力学强度；而且也可以激活多种信号通路参与改善骨折愈合的过程[8]。阿仑膦酸钠(alendronate，ALN)作为首个以骨质疏松为适应证而获准上市的第三代二膦酸盐类药物。其具有抑制骨吸收，降低骨转换、增加骨量而降低骨折发生率、加速骨折愈合[9]。研究表明，阿仑膦酸钠通过增加骨痂量及骨密度以增加骨骼强度，通过减少分解代谢抑制破骨细胞的骨吸收作用，从而提高骨折愈合的程度[10]。

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是骨折愈合的关键性细胞因子之一，具有诱导间充质细胞、骨髓基质细胞迁移、增殖、分化成软骨细胞和成骨细胞，介导软骨及骨形成[11]。其中尤以BMP-2作用最显著，BMP-2通过一系列级联反应激活其下游信号分子促进成骨细胞分化和诱导成骨的能力，参与骨形成过程中的各个阶段[12]。研究表明BMP-2干预能够加速非骨质疏松性骨折愈合速度，缩短愈合时间[13]。本研究表明甲状旁腺激素联合阿仑膦酸钠具有协同上调BMP-2表达，增加骨质疏松性骨折大鼠骨密度，改善生物力学性能及骨组织形态学，加快骨折愈合。

血管形成、恢复骨折断端血供是骨折修复的前提。VEGF是作用最强的促血管生长因子，VEGF可促进新血管生成，恢复骨折血运，VEGF还可直接作用于骨折部位成骨细胞VEGF受体，促进血管微环境中生长因子的表达。VEGF对原始成骨细胞有迁移趋化及分化作用，对骨的形成和重建有功能性的作用[14]。本研究结果表明甲状旁腺激素、阿仑膦酸钠联合用药通过介导VEGF，上调BMP-2表达，促进骨质疏松性骨折大鼠骨痂血管形成，增加骨密度，改善生物力学强度及骨组织形态学，加快骨折愈合。同样，李梅等[15]研究表明，人甲状旁腺素和阿仑膦酸钠均对骨质疏松有效，联合使用可增加骨密度和改善骨力学性能。曾中华等[16]研究表明，在骨折愈合的不同时期，BMP-2和VEGF在成骨细胞中可以互相促进表达，共同调节骨祖细胞的增殖和成骨细胞、软骨细胞的分化，最终完成骨折修复。

综上所述，甲状旁腺激素和阿仑膦酸钠联合用药具有协同促进骨痂血管形成，进而加快骨折愈合。联合用药具有潜在的临床治疗价值。但其对骨质疏松性骨折愈合不同阶段具体信号调控机制还有待进一步研究。