通络刮痧和中药对气滞血瘀证雌性大鼠肝组织Nrf2表达影响的对比研究*

唐也笑， 万荷天一， 罗小光*

(贵州医科大学， 贵州 贵阳 550004)

气滞血瘀证是由于气机郁滞导致血行瘀阻所表现的证候[1]。《医述》曰：“因忧思过度而致营血郁滞不行,或因怒伤血逆而留积于胸膈之间者，此皆瘀血之因也。”情志异常是气滞血瘀证发病的重要原因。有学者认为[2]，气滞血瘀证的发病机理和氧化应激存在关联，氧化应激的主要攻击器官是肝脏[3]，而肝脏等器官中有大量的Nrf2核转录因子表达[4]。Nrf2核转录因子是一种抗氧化正向调控因子，它不但能够延长细胞寿命，维持细胞氧化还原稳态[5]，还能调节多基因表达并参与多种信号传导途径[6]。因此本课题通过建立气滞血瘀证SD雌性大鼠模型，观察通络刮痧和桃红四物汤对模型大鼠肝组织核因子E2相关因子2(Nrf2) mRNA及蛋白表达的影响，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

实验动物：40只6～8周龄、体质量为250～270 g的SPF级成年雌性SD大鼠，由长沙市天勤生物动物实验中心提供，合格证号为SCXK(湘)2014-0010。主要实验药物及试剂：盐酸肾上腺素注射液(天津金耀氨基酸有限公司，批号20170907)，水合氯醛(天津市致远化学试剂有限公司，批号20180910)，刮痧精油。主要仪器设备及工具：TG16G台式高速离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)，刮痧板等。

1.2 方法

1.2.1分组 将40只大鼠随机分成空白组、模型组、中药组以及刮痧组，每组10只。

1.2.2造模 动物适应性饲养1周后，根据文献[7-9]制备气滞血瘀证模型，除空白组外，其余3组大鼠左下腹注射盐酸肾上腺素注射液0.09 mg/kg，1次/d；给药4 h后随机接受以下一种物理刺激：冰水浴，将大鼠置于0～4 ℃恒温水箱，4 min/次,2次/d；烘箱热烘，将大鼠置于50 ℃恒温箱，10 min/次，2次/d；夹尾，将两只大鼠鼠尾用同一根皮筋捆绑，大鼠发怒厮打时松开皮筋，20 min/次，2次/d；束缚，将大鼠用皮筋捆绑束缚，限制其活动1 h，2次/d；倾斜，将鼠笼45°倾斜放置，持续2 h，1次/d。每日给予以上1～2种不同刺激，持续14 d。空白组正常喂养，不做其他任何处理。

1.2.3造模后处理 治疗造模成功后24 h，除空白组外，其它3组大鼠均采取不同的干预措施，模型组抓捕，1次/d；中药组按照24 g/kg桃红四物汤煎剂进行灌胃，1次/d；刮痧组用剃毛器剔除大鼠腹背部毛发,取用少量刮痧精油，涂匀在大鼠的暴露皮肤处，参考《大鼠穴位图谱》[10]，用刮痧板刮拭大鼠膀胱经、督脉(颈部至尾骨)、任脉(颈部至耻骨)，以出红色或紫红色痧粒为止，以不刮破皮肤为度，频率为1次/周，治疗时间为2周。空白组正常喂养，不做其他任何处理。

1.2.4动物处死及标本采集 在末次治疗次日早晨，予各组大鼠左下腹注射水合氯醛麻醉后，心脏采血后处死。5 mL血样本采集入含肝素的采血管中、3 mL血样本采集入枸橼酸钠采血管中，送至中心实验室检测全血黏度(低切、中切、高切)、血浆黏度及血细胞比容等血液流变学指标和部分活化凝血酶原时间(APTT)、凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)及纤维蛋白原(FIB)等凝血功能指标；剖腹后取出肝组织放于离心空管中，并置于-80 ℃密封保存，取出部分肝组织后，用玻璃匀浆器研磨均匀，采用RT-PCR法检测肝组织中Nrf2 mRNA的表达，Nrf2引物，上游5′-TCTGCTGCCATTAGTCAGTCGCTCTC-3′，下游5′-CCACCGTGCCTTCAGTGTGCTTCT-3′；β-actin引物，上游5′-GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3′,下游5′-TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3′。采用Western Blot法检测肝组织中Nrf2蛋白的表达，严格按照说明书操作。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 血液流变学

从表1中可以发现，与空白组相比，模型组大鼠血液黏度以及血细胞比容升高(P<0.05或P<0.01)；与模型组相比，中药组、刮痧组大鼠的血液黏度以及血细胞比容降低(P<0.05或P<0.01)；中药组和刮痧组大鼠比较，血液流变学指标差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠血液流变学指标比较Tab.1 The effect of scraping therapy and TCM on rat hemorheology

与空白组相比，(1)P<0.05，(2)P<0.01；与模型组相比，(3)P<0.01，(4)P<0.05

2.2 APTT、TT、PT和FIB

从表2中可以发现，与空白组相比，模型组大鼠APTT和TT明显缩短，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，中药组、刮痧组大鼠APTT和TT明显延长，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，PT、FIB差异无统计学意义(P>0.05)，中药组和刮痧组大鼠TT、APTT、PT及FIB差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组大鼠PT、TT、APTT、FIB的比较Tab.2 The effect of scraping therapy and TCM on rat PT， TT，APTT and FIB

与空白组相比，(1)P<0.01；与模型组相比，(2)P<0.05，(3)P<0.01

2.3 肝组织Nrf2 mRNA及Nrf2 蛋白表达

RT-PCR技术检测大鼠肝脏组织中Nrf2 mRNA的含量，Western Blot法测定肝脏组织中Nrf2蛋白含量，如图1及图2显示，模型组大鼠肝组织中的Nrf2 mRNA及Nrf2蛋白高于空白组(P<0.05)；与模型组相比，中药组、刮痧组大鼠经治疗后均可上调肝组织Nrf2 mRNA及蛋白表达(P<0.05或P<0.01)；而中药组和刮痧组大鼠比较，差异无统计学意义。

(1)与空白组相比，P<0.05;(2)与模型组相比，P<0.05图1 各组肝组织Nrf2 mRNA表达Fig.1 The effect of scraping and TCM on liver Nrf2 mRNA expression

(1) 与空白组相比，P<0.01;(2)与模型组相比，P<0.01图2 各组肝组织Nrf2蛋白表达的比较Fig.2 The effect of scraping and TCM on liver Nrf2 protein expression

3 讨论

气滞血瘀证多由情志不舒、或外邪侵袭引起肝气久郁不解所致[1]。本研究通过腹腔注射肾上腺素模拟气滞，并施以不可预见性应激刺激来建立符合中医特点的气滞血瘀证大鼠模型。从以往研究者对气滞血瘀证雌性大鼠模型的报道来看，血液流变学是气滞血瘀证的客观诊断标准，凝血功能与气滞血瘀证密切相关[8,11-12]。因此本课题选用血液流变学和凝血指标，判断所建立的大鼠模型是否符合中医气滞血瘀证特点。本次实验研究结果表明，与空白组相比，模型组的血液黏度、血细胞比容都升高(P<0.05或P<0.01)，TT、APTT时间明显缩短(P<0.01)，符合中医气滞血瘀证诊断标准。

氧化应激(oxidative stress)是由于机体活性氧类产生，超过机体内源性抗氧化防御水平而造成的一种氧化和抗氧化失衡状态[13]。气滞血瘀证会引起氧化应激[2]，氧化应激会损伤女性的生殖能力并诱发一系列妇科疾病，如痛经、闭经、卵巢早衰、心血管疾病、肥胖病、更年期综合征女性诸多疾病[14]。“女子以肝为先天”，肝气郁滞是气滞血瘀证女性疾病的主要病因病机，这与古人认为的“女性情绪的多变性易引起肝气不疏，导致肝气郁结”观点不谋而合,因此选择肝组织作为本次实验的研究对象。在氧化应激反应中，Nrf2转录因子起着重要氧化-抗氧化的调控作用，并且在肝脏的表面有Nrf2转录因子的大量表达[4]。本研究选择大鼠肝组织Nrf2转录因子，究其原因是该因子不但能够延长细胞寿命、维持细胞氧化还原稳态[5]，还可以在氧化应激状态下保护肝脏[15]。在正常生理状态下，细胞浆内Nrf2与Keap1结合，当机体ROS水平升高处于氧化应激状态时，Nrf2与Keap1解离，经磷酸化的Nrf2转移至细胞核，与细胞核内的小Maf蛋白结合形成二聚体，与ARE启动NQO1、HO-1、SOD等Ⅱ相解毒酶的转录，翻译后细胞内Ⅱ相解毒酶增加，可加速ROS的清除和代谢，增强组织细胞的抗氧化能力，消除或减轻氧化应激损伤[16-19]。因此肝组织Nrf2表达是否上调可提示能否提高肝组织的抗氧化能力，从而抑制氧化应激。本次实验的数据显示，经治疗干预后的大鼠模型Nrf2 mRNA及蛋白的表达均上调(P<0.05或P<0.01)，促使肝组织的抗氧化能力提高，抵抗氧化应激。

桃红四物汤源于清朝年间知名医家吴谦所著《医宗金鉴》，它不但能够改善机体的凝血功能，降低血液黏度，抑制PLT的粘附和聚集；还能够有效上调组织Nrf2的表达[20-21]。本课题实验结果也支持以上观点，与模型组对比，中药组的血液黏度、血细胞比容均降低(P<0.05)，TT、APTT时间均延长(P<0.05)，肝组织Nrf2 mRNA及蛋白表达上调(P<0.05或P<0.01)。该药方不仅具有活血化瘀的作用，而且能够提高肝组织抗氧化作用，同时还是妇科血瘀证治疗常用的代表方，因此本实验以桃红四物汤灌胃治疗作为治疗对照组。

通络刮痧是基于脏腑-经络-穴位中医皮部理论，用刮痧板等工具在相应经络和穴位进行刮拭，起到刺激作用。通络刮痧除了具有调气行血、活血化瘀、舒筋通络等功效，广泛应用于各种病症的治疗和保健领域，还能够提高肝组织抗氧化能力[22]。由本课题实验结果可见，模型组对比，刮痧组血液黏度降低(P<0.01)、血细胞比容降低(P<0.05)，TT延长(P<0.05)、APTT延长(P<0.01)，肝组织Nrf2 mRNA及蛋白的表达(P<0.05或P<0.01)，刮痧组和中药组各指标之间差异无统计学意义，提示通络刮痧和中药治疗的作用类似，均能上调肝组织Nrf2 mRNA及蛋白质的表达，从而达到提高肝的抗氧化能力，抑制氧化应激的目的。

总之，通络刮痧和桃红四物汤均能降低气滞血瘀证模型雌性大鼠的血液黏度、改善凝血功能、上调肝组织Nrf2 mRNA及蛋白的表达，两者的作用效果类似，无论从蛋白层面还是基因层面均提示两种治疗方法的作用机制均可能与提高肝组织抗氧化能力，改善氧化应激状态有关。由此有理由认为，肝组织Nrf2相关的具体信号通路及机制可能成为治疗和预防女性疾病的潜在抗氧化靶点，值得深入研究。