GOLPH3在6种肿瘤中的表达特点*

于莉娜, 田燕, 赵佩佩, 翁雅倩, 刘桢, 华兴

(1.南方医科大学南方医院 病理科， 广东 广州 510515； 2.南方医科大学 基础医学院 病理学系， 广东 广州 510515； 3.贵州医科大学 临床医学院 病理学教研室， 贵州 贵阳 550004； 4.暨南大学医学院附属广州红十字会医院， 广东 广州 510220)

反面高尔基网的癌基因GOLPH3(golgi phosphorprotein-3)又名GPP34/GMx33/MIDAS，是定位于人类染色体5p13.3、全长3.1 kb、编码分子量为34 kD的磷酸化高尔基体膜蛋白，亦是近年来发现的首个定位于反面高尔基网(TGN)的癌基因[1]。以往研究认为，定位于TGN的蛋白质与肿瘤的发生无直接相关性[2]；但近年研究显示，在蛋白质的修饰中TGN发挥重要作用，尤其在肿瘤表观遗传学中的作用可能远远超过预期，定位于TGN的癌基因GOLPH3在多种实体瘤中的异常扩增现象就是有力佐证[3]。目前关于GOLPH3在肿瘤领域所发挥的确切作用及其机制尚未明确，且缺乏系统的研究和报道。本研究应用生物信息技术对GOLPH3的肿瘤组织分布情况进行分析，筛选出表达上调的癌组织，应用免疫组织化学SP法检查这些上调癌组织中GOLPH3蛋白的表达水平，采用逆转录定量 PCR(qRT-PCR)技术检测上调肿瘤细胞株中GOLPH3 mRNA表达水平， 探究GOLPH3与这几种不同类型肿瘤发生发展的关系，为阐明肿瘤的发生发展提供新的科学依据，亦为肿瘤的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 组织、细胞及试剂

1.1.1组织 病例来源于广州市南方医院病理科2013年1月～2015年12月确诊并经手术切除获得的胃腺癌(STAD)、肝细胞癌(HCC)、乳腺癌(BRCA)、子宫内膜癌(UCEC)、睾丸生殖细胞肿瘤(TGCT)及前列腺癌(SART)组织石蜡标本各30例，选择其癌旁正常组织石蜡标本各10例作为对照组。采用连续切片的方式处理所有组织标本(厚4 μm)。

1.1.2细胞株 人STAD细胞株BGC-823、SGC-790，正常胃黏膜上皮细胞株RGM-1，人HCC细胞株Hep G2、HHCC，人永生化肝细胞株THLE-2，人BRCA细胞株MCF7、SKBr-3，人正常乳腺上皮细胞株MCF10A，人SART细胞株LNCap、PC3，人正常前列腺上皮细胞株RWPE-1，均购自美国ATCC。

1.1.3主要试剂 兔抗人GOLPH3多克隆抗体(购自美国Abcam公司)，即用型EliVisionTMplus试剂盒、DAB显色试剂盒及磷酸盐缓冲液(PBS，购自福州迈新生物技术有限公司)，总RNA提取试剂(购自美国Invitrogen公司)，PrimeScript逆转录试剂盒(Perfect Real Time)及SYBR Premix Ex Taq试剂盒(购自日本TAKARA公司)。

1.2 方法

1.2.1GOLPH3的数字化细胞表达谱分析 以GOLPH3为查询对象，应用GCBI-基因雷达数据库进行搜索，统计GOLPH3在不同肿瘤细胞中的表达丰度。

1.2.2免疫组织化学染色 组织标本均在同一条件下采用SP法进行免疫组织化学染色：65 ℃烤片2 h，利用二甲苯及不同浓度乙醇试剂完成脱蜡及水化处理，利用柠檬酸钠抗原修复液修复抗原后使用双氧水封闭内源性过氧化物酶，山羊血清封闭液处理1 h，加入相应目的蛋白的一抗，4 ℃孵育过夜，使用PBS清洗3次；二抗室温孵育2 h，同样使用PBS清洗样本3次(5 min/次)，通过DAB显色，苏木素复染及树胶封片后，使用光学显微镜采集图片及分析。选用已知阳性的肺腺癌标本作为阳性对照，PBS液代替一抗作阴性对照。

1.2.3qRT-PCR检测 将各种细胞种植于6孔板中，待细胞长满后加入Trizol(1 mL/孔)，充分吹匀后转移至1.5 mL的EP中，冰上裂解30 min；加入三氯甲烷200 μL，剧烈震荡后，静置2 min，在4 ℃及12 000 r/min条件下离心15 min；将上层透明液体转移至新的1.5 mL EP管中，加入等量的异丙醇，缓慢轻柔地上下颠倒混匀，冰上静置10 min，再在4 ℃及12 000 r/min条件下离心10 min。去上清，加入75%乙醇溶液清洗沉淀，在4 ℃及12 000 r/min条件下离心10 min；去上清，干燥沉淀后，加入适量的DEPC水溶解沉淀。使用微量紫外分光光度计检测样本RNA浓度。以RNA总量1 000 ng的标准进行逆转录反应获得cDNA。GOLPH3基因上下游引物序列分别为5′-AAGCCGTTCTTGACAAATGG-3′和5′-ATTGGTGTTGGCCTTCAGAC-3′；内参GAPDH基因上下游引物序列分别为5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′和5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′，每个样本的检测均设立3个重复孔，利用ΔΔCT算法计算目的基因的相对表达量。

1.2.4结果判定 细胞质内出现棕黄色至深棕色颗粒为GOLPH3表达阳性细胞，符合以下标准：(1)细胞结构清晰，(2)阳性颗粒定位准确，(3)着色程度明显高于背景且对比清楚。按阳性细胞的数量评分(A)：阳性细胞数≤15%记1分，阳性细胞数为16%～75%记2分，阳性细胞数≥75%记3分；按细胞染色程度评分(B)：无显色细胞记0分，淡黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分。总分数(T)=A×B，T=0时判定为“-”，T=1～2时判定为“+”，T=3～4时判定为“++”，T=6～9时判定为“+++”，“+～+++”为阳性表达。随机选择5～10个高倍镜视野观察并评分。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 GOLPH3的数字化组织表达谱

结果显示，GOLPH3广泛表达于人类大多数正常组织，在STAD、BRCA、UCEC及TGCT等多种肿瘤细胞中的表达显著上调。见图1。

图1 GOLPH3在不同肿瘤细胞中的表达情况Fig.1 The expression of GOLPH3 in different tumor cells

2.2 GOLPH3蛋白在6种常见恶性肿瘤中的表达

结果显示，GOLPH3表达的阳性信号定位于细胞质内，在癌旁组织中多为弱阳性表达(+)，中等强度阳性表达率仅为8.3%，而在相应STAD、HCC、BRCA、UCEC、TGCT及SART等肿瘤组织中，GOLPH3的表达显著升高，多为中强表达(++/+++)。中强度阳性表达率为96.7%，与相应癌旁组织比较，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1、图2。

表1 GOLPH3在6种恶性肿瘤组织与癌旁组织中的表达Tab.1 Expression of GOLPH3 in malignant tumors and adjacent normal tissues

注：a为胃、b为肝、c为乳腺、d为子宫内膜、e为睾丸、f为前列腺，A为STAD、 B为HCC，C为BRCA、D为UCEC、E为TGCT、F为SART图2 GOLPH3在6种常见恶性肿瘤与癌旁正常组织中的表达水平(SP，×200)Fig.2 The expression level of GOLPH3 in common malignant tumors and adjacent normal tissues

2.3 GOLPH3 mRNA在4种常见恶性肿瘤细胞株的表达

结果显示，GOLPH3 mRNA在人STAD细胞株、人HCC细胞、人BRCA细胞株及人SART细胞株中的表达水平均显著高于其相对应的正常细胞株，差异具有统计学意义(P<0.01)。见图3。

(1)与正常细胞株比较，P<0.05图3 GOLPH3 mRNA在4种常见恶性肿瘤细胞株的表达(qRT-PCR)Fig.3 The expression of GOLPH3 mRNA in four common malignant tumor cell lines and their corresponding control cell lines

3 讨论

近年来，随着分子生物学技术的突飞猛进，新发现的肿瘤相关基因也日益增多[4-6]。在正常细胞基因组中，一旦发生突变或被异常激活后可使细胞发生恶性转化的基因称之为癌基因，癌基因反映的是一种功能的获得，即获得使细胞发生癌变的能力。但是这种功能的获得并不是癌基因的唯一作用[7]，正常细胞的生长、分化和增殖均需要原癌基因的参与[8]。因此确切地说，癌基因是一类具有正常的生物学功能，仅在特殊条件下才会使细胞发生癌变的一类基因[9]。

GOLPH3自首次报道以来，一直被认为是一种磷酸化的高尔基体膜蛋白，参与执行细胞正常的高尔基体的蛋白质分选功能[10]。直到2009年Nature有文章提出，GOLPH3是首个定位于TGN的癌基因[1]，能够促进肿瘤的发生[11-14]。随后这一研究成果引起医学界的广泛关注，认为GOLPH3是一个真正意义上的且具有强大转化能力的癌基因[15-20]。目前关于GOLPH3癌基因功能的研究尚处于起步阶段，其在人体常见恶性肿瘤组织中是否均存在基因活化现象、是否也具有癌基因特性等尚缺乏系统性报道。

生物信息学技术是研究新基因并进行功能研究的重要手段，已广泛地渗透到医学的各个领域。本研究首先通过GCBI数据库对GOLPH3的肿瘤组织分布情况进行初步分析，结果显示GOLPH3广泛表达于人类大多正常组织，在大部分肿瘤细胞株如STAD、BRCA、UCEC、TGCT及SART中存在显著的表达上调；随后，本研究选择临床较常见的相应肿瘤组织标本进行GOLPH3表达验证，结果显示，GOLPH3蛋白在全身多器官癌组织旁的正常组织中多呈低表达(+)，与GCBI数据库分析结果一致，提示GOLPH3作为原癌基因在正常细胞中具有活性，参与细胞正常的生物学功能，而在STAD、HCC、BRCA、UCEC、TGCT及SART等恶性肿瘤组织中，GOLPH3的表达量相对其配对的正常组织显著升高，差异具有统计学意义。由于胃、肝、乳腺及前列腺肿瘤发病率高且严重危害人们生命健康，应用qRT-PCR技术从细胞水平检测了人STAD细胞株、人肝细胞癌细胞、人BRCA细胞株及人SART细胞株及其相对应的正常细胞株中GOLPH3 mRNA表达水平，结果显示肿瘤细胞株中GOLPH3 mRNA表达显著高于相对应的正常细胞株(P<0.01)。以上结果均提示在部分恶性肿瘤中GOLPH3作为原癌基因被活化，参与了相应肿瘤的发生。

综上所述，目前关于肿瘤标志物的研究发展飞速，迄今为止，GOLPH3是首个也是唯一被发现的定位于TGN的癌基因。本研究发现，GOLPH3表达量的上调与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。随着对GOLPH3基因研究的进一步深入，将有力的推动肿瘤的表观遗传学研究，为多种常见恶性肿瘤的诊治提供新的思路和线索。