新型双香豆素类化合物通过Nrf 2/ARE通路诱导OGD神经元保护研究*

王 钧 ，张浩萌，张文彤 ，樊朝阳，李 侠△

1.空军军医大学第一附属医院(西安 710032)；2.空军军医大学第二附属医院(西安 710038)；3.空军军医大学药理系(西安710032)

脑卒中是我国第一位死因，脑缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion injury, I/R)是卒中后脑损伤的重要因素，而氧化应激(Oxidative stress, OS)是I/R的关键机制[1]。核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf 2)控制多种抗氧化反应原件(Antioxidant response element, ARE)，在内源性抗氧化应激系统中扮演关键角色，并通过与ARE的相互作用调控I/R中的氧化应激水平，进而决定损伤细胞的转归[2-3]。

双香豆素类化合物在临床上应用广泛，该类化合物可有效改善神经系统微循环、清除自由基、减轻有害物质聚集，进一步保护神经细胞[4-5]。我们前期研究合成了新型双香豆素类化合物3-CF3-4-CL，初步发现其具有增强神经细胞抗氧化酶活性，清除氧化应激产物的作用。本研究中，拟建立神经元氧糖剥夺(Oxygen glucose deprivation， OGD)模型，以模拟动物水平I/R损伤，检测新型双香豆素类化合物3-CF3-4-CL对神经元生存率、抗氧化酶的mRNA表达、抗氧化酶活性和蛋白水平的影响，明确该药物对OGD损伤神经元的作用和机制，为发现I/R新机制和新型防治方法提供实验基础。

材料和方法

1 实验动物 无特定病原体(Specific pathogen free, SPF)级别健康C57BL/6孕鼠，孕14d；由空军军医大学实验动物中心提供。

2 受试药物 3,3′-(3-三氟甲基-4-氯苯亚甲基)-双-4-羟基香豆素(3-CF3-4-CL)。红外光谱、核磁共振氢谱、高分辨质谱等手段对该新型香豆素类化合物进行分子量、结构和纯度鉴定，结果提示化合物的m/z值与化合物元素组成质量数计算值一致，纯度达99 %以上。

3 皮层神经元原代培养 大脑皮层神经元取自14d龄的C57BL/6胎鼠，显微操作取胎鼠脑组织，剔除脑膜和微血管，小心分离皮质，剪碎，0.25 %胰酶消化15 min，后接种于经多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine，PLL)包被内含10 %胎牛血清的杜尔伯科改良伊格尔(Dulbecco's modified eagle medium , DMEM)培养基的细胞培养板中，接种密度约2500/mm2。次日换含2 % B 27的Neurobasal培养基培养，之后每3天半量换液，继续37 ℃、5 %CO2+ 95 %O2条件培养。

6 q-PCR 用Trizol法提取神经元总RNA，试剂盒逆转录反应；所得cDNA 以焦碳酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonate，DEPC)水3倍稀释，用于实时定量荧光PCR反应；并使用β-actin作内在参照基因；得到ΔCT值用来比较给药前后mRNA相对表达量的变化。所用PCR反应设4个复孔。Nrf 2引物序列为上游CTTTAGTCAGCGACAGAAGGAC；下游AGGCATCTTGTTTGGGAATGTG；扩增长度：227。血红素氧合酶-1(Heme oxygenase-1, HO-1)的引物序列为上游AGGTACACATCCAAGCCGAGA;下游CATCACCAGCTTAAAGCCTTCT；扩增长度：86。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)的引物序列为上游GGTGGGCCAAAGGATGAAGAG；下游：CCACAAGCCAAACGACTTCC；扩增长度：227。另一抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)的引物序列为上游：CAGTCGGTGTATGCCTTCTCG；下游：GAGGGACGCCACATTCTCG；扩增长度为：105。β-actin引物序列上游：GTGACGTTGACATCCGTAAAGA；下游：GCCGGACTCATCGTACTCC；扩增长度为245。

8 Western blot 总蛋白用蛋白裂解液提取，核蛋白、浆蛋白按试剂盒步骤提取。各组蛋白上样量经蛋白定量后分别上样。经过12 %十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶 (Sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel， SDS- PAGE) 电泳分离，湿法转印转后将聚偏氟乙烯 (Polyvinylidene fluoride，PVDF) 膜放入5 %脱脂牛奶室温封闭2 h，使用Nrf 2抗体(1∶500)、HO-1抗体(1∶500)、β-actin抗体(1∶1000)和Histone H3抗体(1∶1000),4 ℃孵育过夜，后加入适当比例稀释的辣根过氧化物酶标记IgG二抗(1∶2000)室温孵育2 h，洗膜缓冲液(Tris buffered saline tween，TBST)漂洗膜3次，每次10 min，加入电化学发光(Electro chemi luminescence, ECL)液，发光成像。Quantity One软件进行光密度分析。目的蛋白的相对表达量为目的条带与对应内参β-actin(或Histone H3)的光密度比值。

1 神经元形态变化 原代神经元在接种于细胞培养板后，第1天观察到细胞稳定贴壁，并有突触形成；第3天神经元突触增多、延长，胞体均匀，胞质饱满；第5天，神经元突起增多并延伸，相互交织成网状，初步形成神经元网络；第7天，神经元发育成熟，突触交互成网明显，最接近其体内状态，可用于后续研究。

2 细胞稳定性和细胞存活率 细胞稳定性实验结果表明，与CTRL组相比，3-CF3-4-CL药物浓度小于50 μg/ml时对神经元无毒性作用(P<0.05)。在细胞存活率实验中，结果表明在3-CF3-4-CL药物浓度逐渐提升后，3-CF3-4-CL表现出对OGD损伤神经元的保护性作用，并在20 μg/ml处保护性效果最佳(P<0.05)。证明3-CF3-4-CL药物在其无毒性浓度区间内，表现出神经保护作用，并在20 μg/ml浓度下保护性效果最佳，故以20 μg/ml作为后续实验药物浓度(图1)。

物料成本是产品开发成本的重要组成部分，物料采购协同，是影响服装产品开发效率的难题。通过PDM系统的实施，采购人员可以通过拍摄物料照片、输入物料参数并上传系统，实现多部门协同共享物料数据；仓管部门可以根据设计部门的进程与指令及时调整样衣物料的仓储状况；PDM系统内完成入库信息采集、领用申请与出库管理。通过系统集成全面开展物料管理，可以有效避免物料供应延后、计划外采购和重复采购等问题。

5 CCK-8检测细胞稳定性及存活率 神经元以2500/mm2的密度接种于96孔板，每孔加培养液100 μl，生长至7d。细胞稳定性实验：取正常培养神经元，以3-CF3-4-CL终质量浓度为0、1、2.5、5、10、20、50、100 μg/ml的培养液培养24 h，后加入含10%细胞增殖试剂盒-8(CCK-8)溶液的Neurobasal培养基，37 ℃孵育2 h。细胞存活率实验：OGD组进行OGD损伤6 h后，常规培养18 h；3-CF3-4-CL处理组OGD损伤6 h后，加入含3-CF3-4-CL 0、1、2.5、5、10、20、30、40、50 μg/ml培养液培养18 h；Control组未行OGD损伤，后各组均加入含10 %CCK-8溶液的Neurobasal培养基，37 ℃孵育2 h。每个浓度设置4个复孔，在450 nm处测定其吸光度。

乌兰察布市地处内蒙古自治区中部，2009年被国家食品药品监督管理局确定为“全国十个地级食品安全示范市”之一；2013年被中国城市竞争力研究会评为“中国十佳食品安全城市”；2014～2015年连续两年被自治区食品安全委员会评为“食品药品安全工作优秀盟市”；2016年，被国务院食品安全委员会列为全国创建食品安全城市试点地区。

3 mRNA水平变化 q-PCR结果表明，与Control组相比神经元内Nrf 2、HO1 mRNA相对表达水平在OGD损伤后升高，在3-CF3-4-CL 20 μg/ml处理组其mRNA表达水平进一步升高(P<0.05)；神经元抗氧化酶SOD、GSH-Px的mRNA相对表达水平在OGD处理后有所下降，而在3-CF3-4-CL 20 μg/ml处理组神经元抗氧化酶SOD、GSH-Px的mRNA表达量显著升高(P<0.05，图2)。

观察组30例患者给予阿司匹林与氯吡格雷联合治疗，阿司匹林治疗方法同对照组一致，同时给予患者氯吡格雷片（乐普药业股份有限公司生产，国药准字：H20123115）口服，75 mg/次，1次/d，连续治疗30 d。

7 氧化指标检测 原代神经元生长至7d，收集细胞，低温高速离心，取上清液，分别检测SOD、丙二醛(Malonaldehyde, MDA)、GSH-Px水平。

所有数据均采用SPSS17.0统计学软件进行处理,其中计数资料用n(%)表示,采用χ2检验,计量资料用(±s)表示,采用t检验,等级资料采用秩和检验,若P<0.05,则表明患者差异有统计学意义。

结 果

4 OGD模型及给药方式 取生长至7d的原代皮层神经元，将培养基换为Earle's平衡盐(Earle's balanced salt solution, EBSS)培养基，在含95% N2和5% CO2的缺氧培养箱中培养6 h，后将细胞取出缺氧箱，常规培养18 h用于后续实验。3-CF3-4-CL溶解于0.1 %二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)，以适当浓度稀释于Neurobasal培养基。

求助渠道畅通V4（78.7）中的二级指标面对面求助渠道畅通V41（77.9）、在线求助渠道畅通V42（78.4）分值均较低。在“以学生为中心”的课堂教学常态下，引导学生学会自学非常重要，但是由于学生的认知差异性，若在自学的过程中碰到的困惑无法及时得到解答，将极大地降低其自学的自信心和能动性，所以教师为其建立畅通的求助渠道是非常重要的。当前，该任课教师此项得分最低，需进行求助渠道的快速完善。如建立该门课程的微信群、QQ群等线上交流平台，建立学生互助奖励机制，分组时尽量考虑同寝室的一组，以便线下互助。

鉴于此，为有效提高建筑业创新驱动发展绩效促进行业可持续发展，根据以上结论提出如下建议。首先是减少政府行政干预，降低政府主导的输入型TFP增长。其次是让市场在建筑业创新驱动发展中发挥决定性作用，增强市场主导的持续地内生型TFP增长。最后是以“放管服”改革等为抓手更好的发挥政府的作用，有效提高科技进步贡献率，促使建筑业创新驱动发展新动能进一步发展。

A：3-CF3-4-CL神经元细胞稳定性实验,与Control组比较(CTRL), aP<0.05；B：3-CF3-4-CL对神经元的保护性作用,与OGD (group 0) 组比较,aP<0.05

图13-CF3-4-CL对神经元的稳定性和保护性作用

A：Nrf 2；B:HO-1；C:SOD；D:GSH-Px。与Control组比较,a P<0.05；与OGD组比较,b P<0.05

4 氧化和抗氧化指标 OGD组与Control组相比较，抗氧化酶SOD与GSH-Px表达量下降，MDA表达量增加(P<0.05)。3-CF3-4-CL 20 μg/ml处理组与OGD组比较，抗氧化酶SOD和GSH-Px活性升高，MDA表达量降低(P<0.05，图3)。

5 蛋白水平变化 Western blot显示，神经元中Nrf 2总白表达量在OGD损伤后与Control组比较无统计学差异(P>0.05)，而3-CF3-4-CL 20 μg/ml处理组Nrf 2总蛋白表达量显著升高(P<0.05)。HO-1蛋白水平在OGD后表达量升高，3-CF3-4-CL 20 μg/ml处理后其表达量进一步升高(P<0.05)。细胞浆Nrf 2蛋白表达量在OGD组下降，在3-CF3-4-CL处理组进一步下降(P<0.05)，细胞核Nrf 2蛋白表达量与之相反，在OGD组升高，3-CF3-4-CL 20 μg/ml处理组进一步升高(P<0.05，图4)。

A:MDA含量变化; B:SOD含量变化; C:GSH-Px含量变化。与Control组比较，a P<0.05;与OGD组比较，b P<0.05

上：免疫印迹法检测蛋白表达；下: 蛋白条带灰度分析。A：Nrf 2；B：HO-1；C：Cytoplasm Nrf 2；D：Nuclear Nrf 2。与Control组比较,aP<0.05;与OGD组比较,bP<0.05

图43-CF3-4-CL对神经元Nrf 2、HO1蛋白表达和Nrf 2核转录的影响

讨 论

本研究通过C57BL/6小鼠大脑皮层神经元原代培养，利用其培养环境稳定可靠、给药方式精准、效果直接的特点，来研究脑缺血再灌注损伤在细胞水平的变化。皮层神经元是中枢神经系统中最重要的结构，改善脑缺血再灌注损伤，保护皮层神经元是干预其预后最为关键的措施[6]。同时皮层神经元也是中枢神经系统中对缺血最敏感的细胞之一，故利用神经元糖氧剥夺模型已是目前公认研究脑缺血再灌注损伤在体外细胞水平各种病理生理过程的最佳手段[7-8]。

双香豆素是一种天然存在的杂环化合物，在机体拥有抗氧化、抗高血压、抗凝血、抗癌等多种生物学活性[9]。而双香豆素类衍生物甚多，目前已报道的双香豆素类衍生物数量已超过2000种，也有研究报导部分双香豆素类化合物拥有显著的神经保护性作用，故以此为基础，深入研究其构效关系，设计合成类似物，从中筛选出新型双香豆素衍生物，开发出高效低毒的神经保护药物潜力巨大[10]。

Nrf 2是一种参与细胞病理生理过程的核转录因子，在对抗氧化应激过程中发挥着关键的调控作用[11]。当细胞处于氧化应激条件时，细胞内活性氧(Reactive oxy gen species，ROS)生成与降解之间的平衡被打破，胞内RO-S过度堆积，透支了内源性抗氧化活性物质，从而对细胞产生不可逆的损伤性作用[12]。细胞氧化应激条件下，Nrf 2可发生结构变化进入细胞核，在细胞核中Nrf 2与抗氧化反应原件结合，通过一系列反应活化Nrf 2/ARE抗氧化通路，同时在通路下游的抗氧化基因也随之激活，如：HO-1、SOD和GSH-Px，它们都是受到Nrf 2/ARE信号通路调控的抗氧化酶，相互作用清除细胞过量产生的ROS，使细胞氧化还原状态趋于平衡，缓解细胞氧化应激损伤[13]。已有相关研究表明，激活Nrf 2/ARE通路在脑缺血再灌注损伤中发挥着神经保护作用[14]，因此以神经元为研究目标，探讨3-CF3-4-CL对神经元糖氧剥夺模型的保护性作用，可为大脑缺血再灌注损伤提供一种新治疗靶点和新思路。

本研究结果表明，小鼠皮层神经元OGD损伤后，神经元细胞稳定性下降，在新型双香豆素类化合物3-CF3-4-CL处理后细胞存活率增加，并在一定药物浓度范围内其细胞存活率提升显著。在3-CF3-4-CL处理后，神经元Nrf 2、HO-1的mRNA转录水平升高，其下游SOD、GSH-Px的mRNA表达也随之增加。Nrf 2总蛋白在3-CF3-4-CL处理后表达量上调，Nrf 2浆蛋白表达量减少、核蛋白表达量增多，提示Nrf 2蛋白进入细胞核,并与ARE相互作用启动抗氧化调控程序。促进下游抗氧化调控基因HO-1的表达,并进一步激活抗氧化酶，即抗氧化酶SOD与GSH-PX活化程度加强，细胞内抗氧化能力提升，清除细胞内过度堆积的ROS,减少MDA含量,最终减轻了神经元受到的氧化损伤，改善神经元细胞内氧化还原状态。以上结果均提示由实验室自主合成的新型双香豆素类化合物3-CF3-4-CL对OGD损伤神经元的保护作用显著。这可为脑缺血再灌注损伤的治疗提供了新干预手段与理论基础。