九华痔疮栓中大黄素和大黄酚定量方法研究

沈小钟 崔穗旭 郑晓娜 李淑娴 吴良发

九华痔疮栓由大黄、浙贝母、侧柏叶（炒）、厚朴、白及、冰片、紫草7味中药材组成，具有消肿化瘀、生肌止血、清热止痛之功效。本品为中药保护品种，收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第十八册，标准号为WS3-B-3359-98，规格为每粒重2.1 g。江西瑞金三九药业有限公司为本品研发和独家生产单位，2007年增加了每粒重1.7 g规格，由国家药品监督管理局批准（标准号为YBZ00182007）。大黄是君药，其主要的活性成分是蒽醌类成分[1-2]，其中大黄素、大黄酚在植物中含量较高[3-4]，蒽醌类化合物具有较强的泻下、消炎、抗菌作用[5-6]。但九华痔疮栓现行标准未对大黄素和大黄酚进行定量控制，为了进一步完善九华痔疮栓的质量标准，本文研究建立了大黄素和大黄酚HPLC含量测定方法。结果表明该法简便、准确、重现性好，可作为本品质量控制和考察工艺稳定性的指标。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪，可变波长紫外检测器；大黄素对照品（批号：110756-200110，含量测定用）、大黄酚对照品（批号：110796-201118，含量测定用）均购自中国食品药品检定研究院；色谱纯甲醇，超纯水，其它试剂均为分析纯级。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

取大黄素、大黄酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成含大黄素3 μg/mL、大黄酚6 μg/mL的混合溶液，即得。

2.2 供试品溶液制备

取重量差异项下的本品，研匀，精密称定2 g，精密加入甲醇25 mL，称定重量，加热回流1小时，取出，放至室温，再称定重量，用甲醇补足减少的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液10 mL，置平底烧瓶中，蒸干，残渣加20 mL的8%盐酸溶液超声溶解，再加三氯甲烷20 mL，加热回流1小时，取出，放至室温，提取液移入分液漏斗中，用适量三氯甲烷洗涤平底烧瓶，并入分液漏斗中，待分层后取三氯甲烷液，盐酸溶液再用三氯甲烷振摇提取3次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 阴性样品溶液制备

取缺大黄的其他六味药材按制法制成大黄阴性对照样品，按照“2.2”项下方法制备溶液，即得。

2.4 色谱条件

色谱柱采用Wondasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温30℃；流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（70∶30），流速1.0 mL/min；检测波长254 nm；进样量20 μL。在上述色谱条件下，对照品、样品及阴性样品色谱图见图1。

2.5 线性范围

精密吸取大黄素（0.103 6 mg/mL）和大黄酚（0.272 5 mg/mL）混合溶液0.1，0.5，1，2，3 mL，分别置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，分别进样20μL测定，横坐标为对照品进样量X（μg），纵坐标为峰面积Y，进行线性回归分析，大黄素回归方程为Y=3 762.260 50X-0.557 32，r=0.999 99；大黄酚回归方程为Y=4 244.299 95X-0.419 75，r=0.999 98。结果表明大黄素在0.008 288～0.248 64 μg之间呈良好的线性关系；大黄酚在0.0218～0.654 μg之间呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验

按“2.4”项下色谱条件连续进样“2.1”项下对照品溶液6次，每次进样量20 μL，测定峰面积，结果大黄素RSD=0.4%，大黄酚RSD=0.3%，表明仪器具有良好的精密度。

2.7 稳定性试验

分别在0，6，12，18，24 h各进样同一供试品溶液2次，每次20 μL，计算峰面积平均值，结果大黄素RSD=0.4%，大黄酚RSD=0.7%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.8 重复性试验

按“2.2”项下方法制备6份供试品溶液，分别精密吸取20 μL，注入液相色谱仪，按“2.4”项下色谱条件测定，结果大黄素含量平均值为35.95 μg/g，RSD为2.0%；大黄酚含量平均值为65.20μg·g-1，RSD为2.1%。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的样品，研匀，取6份，每份1 g，精密称定，分别精密加入大黄素（1.244 μg/mL）和大黄酚（2.18 μg/mL）混合对照品甲醇溶液25 mL，按“2.2”项下方法制备加标溶液，按“2.4”项下色谱条件分别进样20 μL测定，结果大黄素平均回收率（n=6）为99.6%，RSD=2.2%；大黄酚平均回收率（n=6）为95.4%，RSD=2.3%。

2.10 样品测定

按“2.2”项下制备方法和“2.4”项下测定条件，对9批样品中大黄素和大黄酚的含量进行测定，采用外标法计算。结果上述9批样品中每粒含大黄素和大黄酚的总量分别为0.17，0.15，0.23，0.21，0.19，0.18，0.21，0.13，0.20 mg。

3 讨论

3.1 指标成分考察

曾对本品中大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素5种成分的含量进行测定，发现供试品色谱中芦荟大黄素和大黄素甲醚峰面积很小，积分波动大，定量不准确，而大黄酸峰面积很大，通过阴性试验发现大黄酸阴性有干扰，在同一色谱条件下，大黄酸与和厚朴酚色谱峰保留时间基本一致，两者重叠在一起，很难分离，大黄酸峰中包含和厚朴酚峰造成大黄酸含量高于实际含量，因此芦荟大黄素、大黄素甲醚和大黄酸三个成分均不宜作为本品的定量指标，最终确定选择大黄素、大黄酚作为指标成分。

3.2 提取方法考察

曾比较不同溶剂种类、提取方式、提取时间和酸水解时间以及三氯甲烷振摇提取次数对大黄素和大黄酚的含量影响，结果采用甲醇25 mL加热回流1 h，再加酸水解1 h后加三氯甲烷振摇提取3次，能基本提取完全，大黄素和大黄酚的含量可达最高，并且杂质干扰较少，故采用“2.2”项下制备方法。

3.3 检测波长考察

在400～200 nm波长范围内对大黄素、大黄酚对照品甲醇溶液进行光谱扫描，结果大黄素在252.5 nm、大黄酚在255.5 nm波长处有最大吸收，并参考中国药典2015年版一部大黄[7]的检测波长，选择254 nm作为检测波长。

3.4 流动相考察

图1 大黄素对照品（A）、大黄酚对照品（B）、样品（C）、阴性样品（D）色谱图

据文献报道[8-13]，测定大黄中蒽醌类成分多采用甲醇与0.1%磷酸溶液作为流动相，只是两者比例有所不同，本文摸索了流动相比例，发现两者比例为75∶25时，大黄素和大黄酚峰保留时间适中，峰形和分离均较好，故确定流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液（75∶25）。

3.5 检测限与耐用性考察

通过逐级降低质量浓度，进样测定，确定大黄素最低检测限（S/N=3）为1.7 ng，定量限（S/N=10）为3.3 ng；大黄酚最低检测限（S/N=3）为1.7 ng，定量限（S/N=10）为4.4 ng。曾采用三种不同的色谱柱进行测定，结果大黄素、大黄酚峰在各种色谱柱均分离良好，测得含量无显著差异，方法具有较好的耐用性。

3.6 含量限度确定

通过分析9批九华痔疮栓中大黄素和大黄酚总量的测定结果，本品每粒含大黄素和大黄酚总量在0.134 0～0.227 9 mg之间，平均含量为0.187 4 mg/粒。考虑到药材的来源、制剂生产损耗以及贮藏等因素，选择含量的最小值作为限度基点，以80%的系数作为含量限度，暂定本品含大黄素和大黄酚的总量不得少于0.10 mg/粒。

4 结论

本研究建立了九华痔疮栓中大黄素和大黄酚HPLC含量测定方法，简便、准确、重现性好，实用性强，可用于实际生产的质量控制和工艺稳定性的考察指标。