高效液相色谱-串联质谱法测定大鼠组织中的吡蚜酮

于 巍，陈立峰，王智琴，韩 静

(1.沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110016；2.沈阳化工大学，辽宁 沈阳 110142；3.辽宁千一测试评价科技发展有限公司，辽宁 本溪 117000)

吡蚜酮属于吡啶类或三嗪酮类杀虫剂，是全新的非杀生性杀虫剂。关于吡蚜酮在农作物中的残留量测定已有很多报道，如，冯义志等[1]研究了吡蚜酮在小麦中的含量测定方法；徐金丽等[2]研究了吡蚜酮在烟草中的含量测定方法；刘建华、吴亚坚等[3-4]研究了吡蚜酮不同剂型的含量测定方法；齐畅等[5]研究了果蔬中吡蚜酮的测定方法。目前，尚未见吡蚜酮在大鼠组织等生物样品中测定方法的报道。

本研究拟采用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定大鼠组织中的吡蚜酮，探讨最高非致死染毒剂量下吡蚜酮原药在大鼠体内的组织分布特征，考察大鼠主要脏器中吡蚜酮浓度的动态变化过程，并验证HPLC-MS/MS法的专一性、准确性及可靠性，以期为吡蚜酮的慢性毒性以及致癌性研究的剂量选择提供依据，为其安全性评价提供数据支持。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

LC-20A/API4000高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪：美国AB Sciex 公司产品，配有电喷雾离子源(ESI)及Analyst 软件；电子天平：德国Sartorius公司产品；超纯水仪：美国Millipore公司产品，配有0.22 μm终端过滤膜；台式高速冷冻离心机：德国Sigma公司产品，配有1.5 mL 转子；高速分散机：德国IKA公司产品；移液器、电动移液器：德国Eppendorf 公司产品；-20 ℃低温冷冻储藏箱：海尔公司产品；大鼠代谢笼：上海辛迪实验器材有限公司产品。

1.2 主要材料、试剂与实验动物

吡蚜酮原药：纯度99.3%，沈阳科创化学品有限公司产品；吡蚜酮、内标吡虫啉标准品：纯度均大于99.8%，北京万佳首化生物科技有限公司产品；乙腈、50%甲酸：色谱纯，美国Thermo Fisher公司产品；实验用水：由Millipore Synergy UV型超纯水机制备。

SPF级SD大鼠，质量(200±20) g，许可证号为SCXK(辽)2010-0001，由辽宁长生生物技术有限公司提供。动物引入后，饲养于辽宁千一测试评价科技发展有限公司屏障环境动物实验室。

1.3 实验条件

1.3.1色谱条件 色谱柱：Phenomenex Luna C18柱(50 mm×4.6 mm×5 μm)，100 A；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸-乙腈溶液；流速：0.5 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；梯度洗脱程序：0～0.5 min(95%A)，0.5～2.0 min(95%～5%A)，2.0～3.0 min(5%A)，3.0～3.1 min(5%～95%A)，3.1～5.0 min(95%A)。

1.3.2质谱条件 电喷雾离子源(ESI源)；多反应监测(MRM)正离子模式(ESI+)；定量离子对：m/z218.3>105.3(吡蚜酮)，m/z256.1>175.1(内标吡虫啉)；离子源温度：500 ℃；喷雾电压(IS)：5 000 V；碰撞气(CAD)：20.7 kPa；去簇电压(DP)：41 V；辅助加热气(GAS1)：344.7 kPa；雾化气(GAS2)：379.2 kPa；气帘气(CUR)：172.3 kPa；碰撞能量(CE)：30.0 eV。

1.4 实验方法

1.4.1溶液配制 准确称取吡蚜酮原药，用0.5%羧甲基纤维素钠水溶液配成100 g/L供试品溶液，需在24 h内使用。用乙腈配制1.00 g/L吡蚜酮标准储备液，于4 ℃密闭保存，使用时用乙腈逐级稀释成标准工作溶液。用乙腈配制1.00 g/L吡虫啉标准储备液，于4 ℃密闭保存，使用时用乙腈稀释成500 μg/L内标溶液。

1.4.2剂量设计及染毒 根据吡蚜酮在大鼠体内的毒代动力学实验结果[6]，兼顾雄性大鼠急性经口毒性半数致死剂量LD50大于5 000 mg/kg，将给药剂量1 000 mg/kg设为上限[7-8]。随机取21只雄性大鼠，分成6组：1组空白对照(1只)，其余大鼠分成5组，每组4只，按设计剂量开始投药，投药前须禁食约18 h。以经口胃投法一次给足设计剂量，给药后将大鼠放回代谢笼内，自由进食、饮水。

1.4.3样品采集 给药前将空白对照组大鼠解剖，给药后分别在10 min、2 h、96 h、120 h、144 h时间点解剖一组动物(4只)。采用CO2麻醉，腹主动脉放血后解剖，取心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、睾丸、脂肪等脏器，分别用生理盐水和蒸馏水冲洗后，滤纸吸干水分，装入惰性塑料袋中，置于-20 ℃冷冻，待测。

1.4.4样品前处理 取约1.00 g室温解冻后的大鼠脏器样品(睾丸除外，取一侧睾丸全部处理)，不足1.00 g的脏器全部处理，准确称其质量；将样品剪碎后，加入两倍量的乙腈，置于匀浆机匀浆至均匀，即为组织匀浆液。移取适量组织匀浆液至1.5 mL离心管中，以15 000 r/min离心10 min，取200 μL上清液，加入200 μL内标溶液，混匀，待仪器分析。

超过定量上限的样品，采用空白组织基质稀释后，再依照上述方法进行处理和分析。

2 结果与讨论

2.1 分析方法验证

2.1.1标准曲线、定量范围、准确度与精密度

依据文献[9-10]方法考察了吡蚜酮在肝组织基质中浓度的标准曲线、定量范围，同时考察了吡蚜酮在心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、脂肪、睾丸等组织基质中的准确度和精密度。

用乙腈将吡蚜酮标准储备液稀释成浓度分别为1.0、2.0、4.0、8.0、20、80、160、200 mg/L标准曲线工作溶液，用空白肝组织匀浆液稀释标准曲线工作溶液，配制成浓度分别为50、100、200、400、1 000、4 000、8 000、10 000 μg/L标准曲线样品。按1.4.4节方法将样品处理后进行仪器分析。吡蚜酮的保留时间约2.3 min，内标吡虫啉的保留时间约2.9 min，吡蚜酮的最小检出量为0.5×10-9g，最小检出浓度为50 μg/L。以吡蚜酮与其内标吡虫啉峰面积之比为纵坐标，二者浓度之比为横坐标，进行线性回归，得到回归方程为y=ax+b，结果列于表1。结果表明，吡蚜酮在50～10 000 μg/L范围内的线性关系良好，标准曲线的相关系数大于0.98。吡蚜酮标样的典型色谱图示于图1，空白组织色谱图示于图2，给药后的组织样品色谱图示于图3。

用乙腈将吡蚜酮标准储备液稀释成浓度分别为1.6、16、160 mg/L质控样品工作溶液，用空白心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、睾丸、脂肪组织匀浆液序列稀释质控样品工作溶液，配制成浓度分别为80 μg/L(LQC)、800 μg/L(MQC)、8 000 μg/L(HQC)质控样品，每个浓度重复5次，经前处理后进行测定，结果列于表2。3个浓度的质控样品准确度在80%～120%之间，批内精密度相对标准偏差(RSD)均小于15%，说明该方法有较好的准确性和重现性。

表1 吡蚜酮肝组织基质线性方程参数Table 1 Linear equation parameters of pymetrozine in liver tissue matrix

注：a.吡蚜酮；b.内标图1 吡蚜酮标样色谱图 (肝组织基质，1 000 μg/L)Fig.1 Standard chromatograms of pymetrozine (liver tissue matrix, 1 000 μg/L)

注：a.吡蚜酮；b.内标图2 空白肝组织基质色谱图Fig.2 Chromatograms of blank liver tissue matrix

注：a.吡蚜酮；b.内标图3 给药10 min后大鼠肺组织样品色谱图Fig.3 Chromatograms of rat lung tissue sample after administration

组织基质Tissue matrix理论浓度 Theoretical concentration/(μg/L)准确度Accuracy/%精密度相对标准偏差Precision RSD/%心8084.11±3.052.31肝108.00±2.640.87脾103.44±4.892.18肺97.78±3.261.01肾100.80±5.332.66脑104.59±6.891.65肌肉103.07±2.792.00睾丸103.97±4.541.80脂肪85.60±1.562.03心80089.26±6.228.05肝105.80±7.890.45脾102.86±8.353.21肺99.54±6.122.00肾104.53±2.542.10脑102.91±6.770.69肌肉101.73±2.760.77睾丸101.92±4.560.70脂肪89.53±3.220.64心800087.28±5.225.98肝102.17±7.441.69脾103.31±5.211.11肺104.17±6.552.25肾104.49±8.691.50脑101.73±5.431.09肌肉101.60±4.681.31睾丸101.78±4.321.26脂肪87.41±5.192.77

2.1.3生物样品稳定性 因组织样品采集后不能及时进行处理和分析，需考察实际操作储存条件下吡蚜酮组织样品的稳定性。配制理论浓度分别为80 μg/L和8 000 μg/L的肝组织基质样品，每个浓度配制3个平行样品，分为3组。将第1组生物样品3次冻融循环，即于-20 ℃条件下冷冻超过48 h后取出，室温解冻放置12 h，再次冷冻—解冻，共循环3次，按照1.4.4节方法处理和分析；将第2组样品于室温放置6 h，按照1.4.4节方法处理和分析；将第3组样品于-20 ℃条件下放置15天以上，室温解冻，按照1.4.4节方法处理和分析。每一组样品与新配制的LQC及HQC样品各测3个平行样，考察3组稳定性样品峰面积与新配制样品峰面积之比，结果列于表3。结果表明，稳定性样品与新配制样品的峰面积比值均在80%～120%之间，说明吡蚜酮在本研究考察的储存条件下较稳定[9]。

2.2 吡蚜酮在大鼠组织中的分布研究

分析1.4.3节获取的生物样品中吡蚜酮的浓度，得到吡蚜酮在大鼠各脏器组织中的动态分布结果[11-12]，列于表4。可见，吡蚜酮在大鼠体内各脏器组织中均有分布，10 min时，肺中药物浓度最高，脾、心、肌肉和脑次之。比较不同脏器组织中药物浓度随时间的变化可以发现，脑和肌肉中药物浓度峰值出现在10 min，其他组织出现在2 h，比较各组织中药物浓度峰值，按照由高到低顺序排序为：肝>脾>心>肺>肾>肌肉>脑>睾丸>脂肪。在药物浓度达到峰值后，各脏器组织内药物浓度随时间延长逐渐下降，至144 h时，除肝内可检出少量吡蚜酮外，其他各脏器组织中均无检出。

表3 吡蚜酮在肝组织基质中的稳定性Table 3 Stability of pymetrozine in liver tissue matrix n=3)

注：表中数据=(稳定性样品峰面积/理论样品峰面积)×100%

表4 大鼠经口染毒吡蚜酮后在不同组织中的动态分布结果Table 4 Dynamic distribution of pymetrozine in rats after oral administration n=4 μg/L)

注：

以上结果表明，吡蚜酮广泛分布于大鼠全身各脏器组织中，其在组织中的分布动态变化趋势与在血浆中的变化趋势基本一致[6]，并且消除较快，无蓄积倾向。同时，吡蚜酮可迅速通过血脑屏障到达脑组织，也可通过血睾屏障进入睾丸组织，但至144 h时，已消除至低于最低检测限，更进一步证明其无致畸作用[13]。

3 结论

本研究采用HPLC-MS/MS法测定大鼠组织中吡蚜酮浓度，并对分析方法进行确证。结果表明，该方法准确度高、重现性好、线性范围较宽。吡蚜酮组织生物样品在不同储存条件下均较稳定，进一步证实了本研究测试条件的可靠性。

由吡蚜酮在大鼠组织中的分布结果可知，该除草剂经口染毒后，在动物组织中的浓度迅速达到峰值，随后迅速下降，至144 h已经基本完全消除，不存在蓄积倾向，因此是一种较安全的除草剂。

本研究只考察了吡蚜酮原型在大鼠体内的分布状态，尚未考察是否存在代谢产物，因此还需进一步开展深入研究。