二维液相色谱法检测婴幼儿奶粉中的牛磺酸

郑国建，沈龙天鸣，林毅侃，王承平，杨保刚

（上海市质量监督检验技术研究院，上海 200233)

0 引 言

牛磺酸(Taurine)又名2-氨基乙磺酸，是人体重要的氨基酸，可促进大脑的损伤修复[1,2]、提高免疫力[3]、减轻炎症反应[4]、促进视觉机能的发育[5]。

目前用于食品中牛磺酸测定的方法主要包括液相色谱法[6-11]和液相色谱串联质谱法[12-14]。由于食品中牛磺酸含量高，且液相色谱串联质谱仪价格昂贵，所以主要使用液相色谱法，如国家标准GB5009.169-2016[15]。该标准第一法为柱后衍生法。由于该方法使用的色谱柱价格高，且需要使用柱后衍生装置，对实验室要求较高，所以大多数实验室使用标准中的第二法，既丹磺酰氯柱前衍生法。但在第二法中某些基质样品中的杂质会对牛磺酸检测产生干扰。本研究将建立一种二维液相色谱法检测婴幼儿配方奶粉中的牛磺酸，该方法具有准确性高、重复性好、操作简便等优点。

1 实验

1.1 材料与试剂

牛磺酸标准品，丹磺酰氯为分析纯，盐酸甲胺为分析纯，甲酸、三氟乙酸、甲醇、乙腈为色谱纯，亚铁氰化钾、乙酸锌为化学纯，超纯水（由Millipore Milli-Q超纯水仪生产）。

1.2 仪器与设备

Thermo U 3000双三元高效液相色谱仪，配有紫外检测器(DAD)、荧光检测器(FLD)和一个六通阀；Eppendorf 5804离心机；Wiggens Votex 3000涡旋振荡仪。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

第一维色谱柱：Agilent XDB-C18：3.0 mm×150 mm，3.5μm；第二维色谱柱：Thermo Gold PFP(全氟苯基柱)：4.6 mm×150 mm，5μm。

A1和B1流动相对应泵1，A2和B2对应泵2，流动相A1为甲醇，流动相A2为乙腈，流动相B1为质量分数0.1%三氟乙酸水溶液，流动相B2为质量分数0.1%甲酸水溶液。泵1的流速为0.4 mL/min，泵2的流速为1 mL/min；柱温为35℃；进样量10μL；一维使用紫外检测器，其检测波长为254 nm；二维使用荧光检测器，其激发波长为330 nm，发射波长为530 nm。泵1和泵2的梯度如表1所示。

表1 二维液相色谱流动相梯度

1.3.2 标准溶液的配制

标准储备液(质量浓度约50 mg/L)：精密称量5 mg标准品用水定容到100 mL。分别准确取适量上述储备液，用水稀释为质量浓度2，5，10，15，20 mg/L的溶液。

1.3.3 样品处理

样品处理过程参照GB 5009.169-2016[15]第二法：准确称取1 g样品(精确到0.1 mg)于50 mL容量瓶中，加入30 mL水，涡旋10 s，放入超声振荡器中超声提取10min。加入1.0 mL质量分数为15%亚铁氰化钾水溶液，涡旋混合，1.0 mL质量分数为30%乙酸锌水溶液，涡旋混合，用水定容至刻度，充分混匀。样液于8 000 r/min下离心3 min。

准确吸取1.00 mL上清液，1.00 mL浓度为80 mmol/L（pH值为9.5）碳酸钠缓冲液，1.00 mL质量浓度为1.5 g/L丹磺酰氯溶液于10 mL离心管中，涡旋10 s，于室温避光处静置反应2 h(1 h后振摇1次)，加入0.10 mL质量浓度为20 mg/L盐酸甲胺溶液涡旋混合，避光静置至沉淀完全。取上清过0.22μm尼龙滤膜后进液相色谱分析。

2 结果与分析

基于多种分离机理的多维色谱可用于复杂基质中目标化合物的分离和定量测定[16-24]。其中的二维色谱技术结构简单，对设备要求低，已经越来越多的应用到食品分析中[16,24-26]。

实验对第二维色谱的的流动相进行了考察，分别考察了纯水、质量分数0.1%三氟乙酸水溶液、以及质量分数0.1%甲酸水溶液作为B2相。实验发现在使用纯水时牛磺酸的色谱峰峰宽较宽，且对称性差；使用酸性溶液能明显改善峰型，而使用0.1%甲酸溶液时牛磺酸的荧光响应要大于在0.1%三氟乙酸水溶液中的响应（色谱图未给出）。所以最终选择0.1%甲酸水溶液作为B2相。

2.1 二维色谱流路构建与切换时间的确定。

2.1.1 阀切换时间的确定

为了保证将一维色谱柱中的牛磺酸全部切割到第二维色谱柱，首先使用标准品对一维色谱图中的牛磺酸出峰位置进行确认，如图1所示。由图1可以看出牛磺酸在一维色谱柱的保留时间为4.7 min。因此将阀切换时间的设定在4.2 min和5.2 min。二维液相色谱的具体连接方法如图2所示。在0~4.2 min，六通阀处于1、2连通状态；在4.2~5.2 min，六通阀处于1和6连通状态；5.2~15min，六通阀处于1和2连通状态。

图1 牛磺酸标准品一维色谱

图2 二维液相系统连接示意图

2.1.2 色谱柱的选择

二维液相色谱既要考虑2个维度的体系的兼容性，又要考虑这2个维度存在一定的差异，因此该研究选用了C18作为第一色谱柱，PFP色谱柱作为第二色谱柱。在表1液相条件下，牛磺酸可以和杂质得到很好的分离，如图3所示。

图3 样品中牛磺酸的二维液相色谱色谱

2.2 线性关系和检出限

使用储备液，用水稀释成不同质量浓度的标准工作液，然后经过和样品一样的衍生过程反应后，过滤进样分析。以标准工作液质量分数为横坐标，峰面积为纵坐标制作标准曲线，该方法的线性相关系数r≥0.999。以3倍信噪比（S/N）计算方法的检出限为0.02 mg/100g，以10倍信噪比(S/N)计算方法的定量限为0.05 mg/100g。GB5009.168-2016[18]第二法的定量限为0.1 mg/100g，该方法可以满足日常婴幼儿奶粉中牛磺酸的定量需求。

2.3 回收率和精密度

使用乳清粉进行加标回收率和精密度实验。

以定量限、1倍目标值和1.5倍目标值三个水平进行加标回收实验。结果如表2所示。

由表2可知：该方法加标回收率为97.8%~99.0%，相对标准偏差为2.56%~3.25%。表明方法回收率和精密度良好。

2.4 实际样品检测

采用该方法和GB5009.168-2016第二法[18]对市售的6种婴幼儿配方奶粉，1个部分水解配方奶粉，以及1个有机奶粉原料进行测定，结果如表3所示。

表3 实际样品检测结果 mg/100g

由表3可以看出：对于1~6号样品采用两种方法得到的结果基本一致，结果偏差在小于5%。说明该方法在检测普通婴幼儿配方奶粉时和国标方法具有很好一致性。

在检测部分水解配方奶粉时，使用GB5009.168-2016第二法测得的结果为65.2 mg/100 g，按产品能量为2 000 k J/100 g计算，牛磺酸的含量为3.26 mg/100 kJ，超出国标限量要求。使用该方法的测得值为1.84 mg/100 kJ，符合国标限量要求。

对于有机奶粉原料样品，我们从供应商得知该样品为还未添加牛磺酸的原料粉，其本底牛磺酸质量分数应该很低。但是使用GB5009.168-2016第二法得到的数值为29.5 mg/100 g，明显大于该方法得到的9.12 mg/100 g。

从水解配方奶粉和有机奶粉原料的数据可以进一步说明使用该方法可很好的消除某些特殊基质样品中的基质干扰，得到比国标方法更加准确的牛磺酸含量。

3 结论

本文建立了一种使用二维液相色谱检测婴幼儿配方奶粉中牛磺酸含量的检测方法，对该方法进行了方法学验证，该方法在2~20 mg/L质量浓度范围内具有良好的线性，线性相关系数r≥0.999；定量限为0.05 mg/100g；在 0.05 mg/100g，40 mg/100g，60 mg/100g三个质量分数水平的加标回收在97.8%~99.0%之间，相对标准偏差为2.56%~3.25%。使用该方法对实际样品进行检测，证明该方法准确性高、重复性好、操作简单，抗干扰能力强，适用于婴幼儿奶粉中牛磺酸的测定。