酸性乳糖酶对奶粉中乳糖水解工艺的研究

荣智兴，莫红卫，戴智勇，汪家琦，刘洋汝，彭小雨，陈希苗

（澳优乳业（中国）有限公司，长沙410200）

0 引 言

乳糖在自然界中仅存在于哺乳动物的乳汁中，是乳制品中主要的碳水化合物。在母乳中乳糖是婴幼儿重要的能量来源，半乳糖能促进脑苷脂类和黏多糖类的生成，因而对幼儿智力发育非常重要。但是作为双糖的乳糖须在乳糖酶作用下，分解成半乳糖和葡萄糖，才能被小肠吸收被人体利用[1-2]。

乳糖不耐受是由于乳糖酶分泌少，不能完全消化分解母乳或牛乳中的乳糖所引起的非感染性腹泻[3-4]。这在很大程度上限制了人体对乳制品营养成分的消化吸收，从而限制乳制品在人们日常生活中的普及。据调查，亚洲人口中约有70%以上人群患有不同程度的乳糖不耐受症，中国人是乳糖不耐受的高发人群，乳糖酶缺乏发生率在80%~95%[5-6]。

本文选用由米曲霉发酵提取的酸性乳糖酶，利用其定向水解奶粉中的乳糖，研究其酸性环境下水解条件，使乳糖能达到最大限度的水解，以显著降低乳糖含量，从而使乳糖不耐受的问题得到解决，也为含乳糖酶的乳制品和直接服用的乳糖酶产品开发提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

代膳全脂奶粉，酸性乳糖酶（1×105ALU/g），其他所有试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

葡萄糖试剂盒，上海荣盛生物技术有限公司；摇床振荡培养箱，上海智成分析仪器有限公司；DK-8AX恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；精密pH计，METTLER TOLEDO。

1.3 主要检测方法

1.3.1 乳糖测定[7]

采用直接滴定法（GB5009.7—2016）测定乳粉中的乳糖含量。

1.3.2 乳糖水解率测定[8]

按照葡萄糖试剂盒说明来检测样品中葡萄糖的含量（mg/mL）。

乳糖水解率（%）=1.9×样品中的葡萄糖含量（mg/mL）/水解前的乳糖含量（mg/mL）×100

1.4 工艺流程

全脂乳粉→加水冲调→调节pH→杀菌→冷却降温→加酶→摇床恒温水解→灭酶（100℃，5 min）→降温→水解率检测

1.5 操作要点

（1）冲调，依据产品说明书，8平勺（约32 g）放入240 mL温开水中冲调；（2）调节pH，采用1 moL/L的HCL调节到合适pH值；（3）杀菌，冲调后并调好pH的奶液水浴65℃，30 min，冷却至30℃左右；（4）加酶水解，在无菌条件下加入酸性乳糖酶，放入摇床（150 r/min）中恒温水解；（5）灭酶检测，反应完后水解液放入95℃，5 min水浴锅中灭酶并检测乳糖水解率。

1.6 单因素分析酸性乳糖酶的适宜酶解条件

奶粉中乳糖的水解反应取决于乳糖酶和底物特性，与水解条件如乳糖酶种类、酶活、底物浓度、温度、pH值和水解时间等因素有关。通过对酶解反应因素对乳糖水解率的影响，选择最佳的酶解条件。

1.7 响应面优化酸性乳糖酶水解条件

在单因素试验结果的基础上，选择对乳糖酶水解率较大的3个因素：酶添加量、水解温度和pH。根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，采用三因素三水平响应面分析法进行试验设计。响应面的分析因素与水平设计见表1。

表1 响应面分析的因素和水平

2 结果与分析

2.1 单因素分析酸性乳糖酶的适宜酶解条件

2.1.1 乳糖酶添加量E/S的确定

由图1可知，酸性乳糖酶的添加量在0.05%~0.15%时，乳糖水解率随添加量的增大而逐渐增大，当添加量继续增大时，乳糖的水解率变化很小并逐渐趋于稳定，综合考虑效果和成本，选择0.15%为酸性乳糖酶的添加量。

2.1.2 酶解温度的确定

从图2可以看出，乳糖水解的最适温度为45℃，乳糖的在酸性乳糖酶作用下的水解率随温度的变化为先增后降的规律。最大水解率出现在中间酶解的最适温度处，因此选择45℃为乳糖水解温度。

2.1.3 酶解pH的确定

从图3可以看出，乳糖水解的最适pH为5，乳糖的在酸性乳糖酶作用下的水解率随pH的变化也是先增后降的规律。最大水解率出现在中间酶解的最适pH处，因此选择酸性乳糖酶的水解pH 5。

2.1.4 酶解时间的确定

由图4可知，乳糖水解率随时间呈增长趋势，在3 h后乳糖的水解率基本趋于稳定，此时水解率达70%以上。

图1 E/S对乳糖水解率的影响

图2 温度对乳糖水解率的影响

图3 pH对乳糖水解率的影响

图4 时间对乳糖水解率的影响

2.2 酸性乳糖酶水解条件响应面优化结果

2.2.1 响应面设计实验方案的结果

由于乳糖水解率在3 h后基本稳定，且后面影响最小，故保持水解时间为3 h不变，依据E/S、温度和pH对酸性乳糖酶水解工艺的影响，采用响应面法Box-Benhnken中心组合设计原理[9]，以酸性乳糖酶添加量、水解温度和pH为自变量，以奶粉中乳糖的水解率为因变量设计了3因素3水平共计17个试验点实验方案，实验结果见表2。

表2 响应面设计方案及实验结果

2.2.2 回归方程的建立与分析

利用响应面设计软件Design Expert8.05对表2的数据进行回归分析，分析结果见表3和表4。

将17个试验点的数据用Design Expert软件进行回归分析,以乳糖水解率为响应值，经多元回归拟合后，各实验因子对乳糖水解率的影响可以通过以下二次回归方程表示：

乳糖水解率=75.72＋6.70A＋2.23B－0.58C－7.29A2－20.94B2－6.03C2+2.45AB－0.40AC＋1.4BC

由表5的分析结果可知，该模型的F值为71.29，远大于 F0.01，达到极为显著水平（“Pr＞F”值<0.0001），由“Pr＞F”值可知A、B、A2、B2和C2项也是显著的，乳糖水解过程中各因素对乳糖水解率的影响次序为：E/S＞温度＞pH。该方程失拟项的F值为6.12，P值为0.0563，则失拟检验不显著（“Pr＞F”值＞0.05），这表明整个拟合区域的拟合情况良好，证明了该模型的合理性，能准确模拟各因素对乳糖水解率的影响。

由表4可知，模型的R2为0.9892，说明该模型能解释98%的乳糖水解率的变化。R2adj＝0.9753和R2＝0.9892值较接近，说明实验预测值在可行区间内。由此可说明该模型与实际情况的拟合较好，可用该模型对不同条件下的乳糖水解率进行预测。

2.2.3 响应因素水平的优化

用Design Expert软件，依照回归方程绘制E/S、温度和pH的响应面，如图5-图7所示。

表3 回归方程系数显著性检验表

表4 模型可信度分析表

图5 乳糖酶添加量和温度对乳糖水解率

图6 乳糖酶添加量和pH对乳糖水解率的影响的影响

图7 温度和pH对乳糖水解率的影响

由图可以看出，3个响应曲面均为开口向下的凸型曲面，说明响应值(乳糖水解率)存在极大值。图5显示，在选定的E/S和温度的条件范围内，乳糖水解率的极大值坐位于两坐标轴编码的中间区域。由图6和图7可知，回归方程的响应值（乳糖水解率）对其中两个因素水平变化而变化的趋势和极大值点都与图5相似。由表3也可以看出，E/S、温度和pH三个因素之间的交互项AB、AC、BC的“Pr＞F”值也均大于0.05，都属于不显著水平。由此可知，E/S、温度和pH值这三个因素之间的交互作用不明显。

在选取的各因素范围内，由Design Expert软件进行响应面优化分析得到，酸性乳糖酶对奶粉中乳糖水解的最适工艺条件为：E/S 0.16%、温度45.31℃和pH 4.95，此时的乳糖水解率是76.87%。

2.2.4 验证试验的结果

为进一步验证该实验的方法条件的可靠性，采用上述条件进行奶粉中乳糖的水解并重复3次试验，实际测得奶粉中乳糖水解率为76.5%，预测值与实际值无显著性差异。因此，采用响应面分析法优化而得到的酸性乳糖酶水解奶粉中乳糖的条件参数准确可靠，可操作性好。

3 结 论

根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理，对乳糖水解率影响比较明显的乳糖酶添加量、温度和pH 3个工艺条件进行响应面优化，得到酸性乳糖酶对奶粉中乳糖水解的最适工艺条件为：乳糖酶添加量0.16%、温度45.31℃、pH 4.95，在此条件下奶粉中乳糖的水解率的预测值是76.87%；在验证试验中，实际测得乳糖水解率为76.5%，与响应面优化的奶粉中乳糖水解率预测值无显著性差异。

此研究采用酸性乳糖酶来水解奶粉中的乳糖，在喝奶时添加酸性乳糖酶，帮助水解乳糖，促进牛奶营养成分的吸收和利用，解决乳糖不耐受人群喝奶的困扰，也为含乳糖酶的乳制品和直接服用的乳糖酶产品开发提供一定的理论基础。