痰热清注射液辅助化疗对Lewis肺癌模型小鼠免疫功能及血管内皮生长因子、血管抑素、内皮抑素水平的影响

任威 李娟

(湖北省肿瘤医院药学部，湖北 武汉 430079)

化疗是治疗肺癌的主要措施之一，然而化疗药品毒性强，甚至降低患者的免疫功能，因此，选择一种疗效显著、安全性高的化疗药物尤为重要〔1，2〕。痰热清注射液是一种中成药，成分包括金银花、黄芩及熊胆粉，对于各类感染性疾病有显著治疗效果〔3〕。血管内皮生长因子(VEGF)、血管抑素(AS)、内皮抑素(ES)均为外周血管生成调节因子，主要通过抑制肿瘤血管内皮细胞增殖达到抗肿瘤目的〔4〕。本次研究进一步分析痰热清注射液辅助化疗对Lewis肺癌模型小鼠免疫功能和VEGF、AS、ES水平的影响。

1 材料和方法

1.1材料 86只4～6周龄小鼠，购自武汉大学实验动物中心，体重18～22 g，平均(20.31±0.72)g。Lewis肺癌瘤株购自上海信裕生物科技有限公司。DW-86L626型低温冰箱购于四川蜀科仪器有限公司，LD-5M立式低速冷冻离心机购于青岛海尔股份有限公司，精密移液器购于端士Socorex 公司，BIO-RAD酶标仪购于美国 BIO-RAD伯乐公司。酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(Andy-gene公司提供)，包括小鼠外周血VEGF试剂盒(批号：HTAC017)、AS试剂盒(批号：HTAC011)、ES试剂盒(批号：HTAC023)、γ干扰素(IFN-γ)试剂盒(批号：HTAC015)、白细胞介素(IL)-2试剂盒(批号：HTAC012)、肿瘤坏死因子(TNF)-α试剂盒(批号：HTAC009)。

1.2分组及接种方法 选取6只小鼠作为备用，其余80只小鼠随机分为对照组、顺铂组、痰热清组及联合组，每组20只。除对照组外，其他3组均行Lewis肺癌瘤株接种处理：应用37℃的温水对Lewis肺癌瘤株进行复苏处理，并调整瘤株密度至1×107/ml。选择2只备用小鼠，定位其右腋，分别皮下接种0.1 ml瘤株，11 d后以脱颈法处死小鼠，选择生长状态较好的癌组织进行洗净处理，剪碎、研磨，提取细胞。再选2只备用小鼠进行第二轮接种。重复上述操作至第三轮接种后，将最后提取的肿瘤细胞分别接种于顺铂组、痰热清组与联合组小鼠的右腋皮下。

1.3治疗方法 接种后1 d，对照组注射1.5 mg/kg的生理盐水，隔天1次；顺铂组注射1.5 mg/kg顺铂(德州德药制药有限公司，国药准字H20023236)，隔天1次；痰热清组经腹腔注射痰热清注射液(上海凯宝药业股份有限公司，国药准字Z20030054)，剂量为3.5 ml/kg，隔天1次；联合组注射1.5 mg/kg顺铂+3.5 ml/kg痰热清注射液，隔天1次。4组均持续注射2 w。

1.4指标观察 (1)顺铂组、痰热清组及联合组小鼠接种5、10、14 d时的肿瘤体积。应用动物肿瘤测量跟踪系统，电子数显卡尺测量肿瘤最长、最短径，肿瘤体积=肿瘤最长径×最短径×最短径/2〔5〕。(2)4组小鼠接种14 d后的免疫指标水平。以免疫透射比浊法检测小鼠外周血中免疫球蛋白(Ig)G、补体C3水平，取外周血离心分离血清，通过标准品制作标准曲线，并在波长340 nm处检测血清IgG、补体C3水平，操作按试剂盒说明书进行。(3)4组的炎性因子(IL-2、TNF-α、IFN-γ)及血清VEGF、AS、ES水平。取4组小鼠适量股动脉血后静置30 min，4 000 r/min离心15 min，取上层血清并保存于DW-86L626型低温冰箱中备用。应用酶标仪并以ELISA法及其配套试剂盒检测VEGF、AS、ES、IL-2、TNF-α、IFN-γ等水平，严格依据试剂盒说明书操作。

1.5统计处理 采用SPSS20.0软件，两两比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1顺铂组、痰热清组及联合组小鼠接种后5、10、14 d时的肿瘤体积 接种后5 d，3组肿瘤体积无明显差异(P>0.05)；接种后10、14 d，3组肿瘤体积差异有统计学意义(P<0.05)，且联合组肿瘤体积明显小于顺铂组及痰热清组(P<0.05)，见表1。

表1 顺铂组、痰热清组及联合组接种不同时间的肿瘤体积比较

与顺铂组比较：1)P<0.05；与痰热清组比较：2)P<0.05；与本组接种后5 d比较：3)P<0.05；与本组接种后10 d比较：4)P<0.05

2.24组免疫指标比较 4组IgG与C3水平整体比较差异有统计学意义(P<0.05)。痰热清组IgG与C3水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；顺铂组、联合组IgG与C3水平明显低于对照组(P<0.05)，且联合组的IgG与C3水平均明显低于痰热清组、高于顺铂组(P<0.05)。见表2。

表2 4组免疫指标水平比较

与对照组比较:1)P<0.05；与顺铂组比较:2)P<0.05;与痰热清组比较:3)P<0.05；下表同

2.34组炎性因子水平比较 4组IL-2、TNF-α及IFN-γ水平整体比较差异有统计学意义(P<0.05)；顺铂组、痰热清组、联合组的IL-2和IFN-γ水平均明显低于对照组，TNF-α水平明显高于对照组(P<0.05)；痰热清组IL-2、IFN-γ水平明显高于顺铂组，TNF-α水平明显低于顺铂组(P<0.05)。联合组的IL-2水平明显高于顺铂组，TNF-α水平明显高于痰热清组，IFN-γ水平明显低于痰热清组(P<0.05)，见表3。

表3 4组炎性因子水平比较

2.44组VEGF、ES及AS水平比较 4组间VEGF、ES及AS水平整体比较差异有统计学意义(P<0.05)；顺铂组、痰热清组、联合组的ES、AS水平明显低于对照组，VEGF水平明显高于对照组(P<0.05)；联合组、痰热清组VEGF水平明显低于顺铂组，ES水平明显高于顺铂组(P<0.05)；痰热清组AS水平明显高于顺铂组(P<0.05)；联合组ES、AS水平明显低于痰热清组，VEGF水平明显高于痰热清组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 4组VEGF、ES及AS水平比较

3 讨 论

肺癌是一种常见的恶性肿瘤，发病早期无显著症状，难以及时发现。多数患者就诊时已进入中晚期，根治性治疗难度较大，可经化疗延长患者的生存时间及提高生存质量〔6，7〕。但是，在患者化疗治疗期间，机体免疫能力会受化疗药物的影响。为了提升化疗效果并且降低化疗药物对正常细胞、免疫能力的影响，临床中常在化疗期间采用中药制剂辅助治疗，痰热清注射液即为其中较常用的一种。痰热清注射液属于中药复方制剂，生物调节性较好，目前已在恶性肿瘤治疗中获得广泛使用〔8〕。

本研究结果显示，痰热清注射液辅助化疗能更有效降低小鼠肿瘤体积，提示痰热清注射液辅助化疗能增强化疗的效果。痰热清注射液主要由黄芩、山羊角、熊胆粉、连翘、金银花等五味清热的中药组成，其中黄芩为君药，具有清热解毒、止咳润肺的功效；山羊角和熊胆粉为臣药，起到化痰止咳、解痉熄风的作用；连翘、金银花为佐药，起到清热解毒的作用〔9〕。痰热清注射液可有效缓解肺癌小鼠咳嗽、咯痰等症状，联合常规化疗药物顺铂可更好地改善小鼠的治疗效果，进而更有效地缩小肿瘤体积。本研究还显示，使用顺铂进行化疗后，小鼠的免疫功能会受到一定的影响，而采用痰热清注射液辅助化疗可以减轻顺铂对小鼠免疫功能造成的影响。已有动物实验证明，化疗会导致小鼠的胸腺指数、白细胞数、淋巴细胞数、单根股骨骨髓细胞数降低，而痰热清注射液辅助化疗可明显减轻这种现象，逆转化疗对小鼠免疫功能的影响〔10，11〕，这与本研究得到的结论相似，然而其具体的作用机制还有待进一步研究。肺癌小鼠体内的巨噬细胞、活化T细胞会分泌大量IFN-γ，在抗肿瘤免疫过程中发挥重要的作用；TNF-α由巨噬细胞与活化T细胞分泌，参与炎症反应和免疫调节过程；IL-2对细胞因子、干扰素成分可发挥诱导作用，对免疫调节有重要的作用，促进Fas抗原表达，进而促进细胞凋亡。本研究结果还显示，顺铂可降低小鼠体内IL-2和IFN-γ水平，增加TNF-α水平，而痰热清注射液辅助化疗可缓解IL-2和IFN-γ降低及TNF-α升高的程度，从而增强其淋巴细胞的抗肿瘤免疫活性，在有效缓解炎性反应的同时改善其免疫状态〔12〕。VEGF是一种促进外周血管生成的因子，主要通过影响血管内皮细胞PI3K起到调控的作用〔13〕；AS和ES是重要的血管生成抑制因子，其中AS通过抑制肿瘤血管的内皮细胞增殖和迁移达到抑制血管生成的目的，而ES可以对新肿瘤血管的生成造成干扰。本研究显示，顺铂化疗后ES、AS水平降低，VEGF水平升高，而采用痰热清注射液辅助化疗可抑制这种趋势，进而抑制新生血管生成，避免肿瘤快速生长。

综上所述，痰热清注射液辅助化疗可有效降低Lewis肺癌小鼠的肿瘤体积、增强免疫功能，可能是通过调节IL-2、TNF-α及IFN-γ等细胞因子的水平来调节小鼠的免疫功能，通过抑制新生血管生长来缩小肿瘤体积，然而其具体的作用机制还有待更为深入的研究。