ROR2在中老年宫颈癌中表达和意义及对宫颈癌细胞增殖的影响

刘春静 陈隽 李丽萍 陆相辉

(齐齐哈尔医学院附属第三医院，黑龙江 齐齐哈尔 161000)

宫颈癌是中老年女性常见恶性肿瘤之一，且中老年宫颈癌患者并发症较多，预后差，针对中老年宫颈癌患者探寻新的治疗方法有重要意义〔1〕。人受体酪氨酸激酶样单受体(ROR)2已经证实在多种肿瘤中过表达，并且与患者预后密切相关〔2，3〕。本研究旨在进一步探索ROR2在中老年宫颈癌患者中的表达及其生物学功能和相关分子机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择齐齐哈尔医学院附属第三医院2012年4月至2016年9月收治的中老年宫颈癌患者80例，收集肿瘤切除后的癌组织和癌旁组织(癌周2 cm)。纳入标准：年龄≥50岁；肿瘤原发于宫颈；均经活组织检查或手术，有明确病理学诊断，符合国际妇产科联盟(FIGO)分期；所有患者术前无输血史，未进行过放化疗。排除标准：合并其他恶性肿瘤，合并严重心肝肾等重要脏器功能障碍患者；合并其他较为严重的妇科疾病者；认知障碍及精神病患者；无完整的临床及随访资料患者。患者平均年龄(70.3±5.71)岁；肿瘤病理类型：鳞癌(60例)，腺癌(20例)；肿瘤大小：<4 cm(29例)，≥4 cm(51例)；淋巴结转移：无(36例)，有(44例)；绝经后激素调节：无(34例)，有(46例)；FIGO分期：Ⅰ期(48例)，二期(32例)；病程：3～15个月。研究获得病人及家属的同意并遵循医学伦理委员会的规定。

1.2主要试剂和仪器 ROR2(货号：ab190145)，增殖细胞核抗原(PCNA，货号：ab152112)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体均购于美国abcam公司，二抗购于美国CST公司。转染用lipo2000试剂购自Invitrogen。CCK-8试剂盒购于碧云天生物公司。其他试验材料由本实验室提供。Western印迹和凝胶成像系统购买于北京六一生物公司，酶标仪购于芬兰雷勃公司。ROR2的小干扰(si)RNA和对照RNA由上海吉玛制药公司合成，序列如下ROR2 siRNA1：5′-GUCAUCGCUUGCCUGUUC-3′；ROR2 siRNA2：5′-ACCAACCCUUGAGCAUGA-3；Control siRNA：5′-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

1.3实时定量PCR 应用高纯总RNA 快速提取试剂盒提取癌组织和癌旁组织中的总RNA，将提取的RNA样本进行反转录获得对应的cDNA。然后进行实时荧光定量分析，所用引物序列如下：ROR2正义链5′-CCACTGGGGTTCTATATGTGCG-3′，反义链5′-AAATAGTCCGGTTCCCAATGAAG-3′；GAPFH正义链5′-ACCCCAGCAAGGACACTGAGCAAG-3′；反义链5′-GGCCCCTCCTGTTATTATGGGGGT-3′。反应体系总体积20 μl，包含1 μl cDNA模版，各0.5 μl 的上下游引物，10 μl SYBR GREEN master mix，其余用双蒸水补齐。反应条件：95℃ 10 s；40个循环：95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s；4℃ 5 min。ROR2的相对表达计算通过2-△△CT方法。

1.4免疫组化 切片常规脱蜡(依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精中)，脱蜡后加入3%过氧化氢(H2O2)浸泡10 min后磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡5 min/次，3次。加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中，中火蒸煮 5 min，冷却至室温，反复蒸煮3次。冷却，倒掉柠檬酸溶液，PBS洗3次，每次5 min。擦干组织周围的 PBS 液，加山羊血清工作液放置37℃孵箱温育30 min后倾去。小心擦干载玻片上组织周围的血清，滴加鼠抗人的ROR2一抗(1∶100)4℃孵育过夜。PBS冲洗3次，每次5 min，山羊抗鼠的二抗37℃孵育30 min。 PBS清洗后滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育15 min，PBS冲洗5 min，洗3次，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。

1.5结果判断 染色强度判定：染色强度分为0，1，2，3分，依次为：无染色，弱染色，中等强度染色，强染色。阳性细胞率判定：0为<5%；1为5%～24%；2为25%～49%；3为50%～74%；4为≥75%。计算染色强度和阳性细胞率的总评分，0～2分判定ROR2表达为阴性，3～7分判定ROR2表达为阳性。两名高年资病理科医生双盲法读片。

1.6细胞培养和转染 人鳞状子宫颈癌细胞(SiHa)购自美国ATCC，在本实验室冻存和传代。细胞系在含有10%血清的DMEM培养基中培养。培养基加入青霉素(100 U/ml)和链霉素(100 μg/ml)，细胞被放置在含5% CO2，37℃培养箱中培养。SiHa细胞复苏培养传代2次后，待细胞融合度达到 80%～90%时，对细胞进行转染。按照脂质体(lipo 2000)转染试剂操作说明，转染SiHa细胞。细胞分为4组：Mock组(不作任何处理)、siRNA 对照(siCtrl)组和 ROR2-siRNA1转染(SiRNA1)组，ROR2-siRNA2转染(siRNA2)组。

1.7细胞活力检测 使用CCK-8试剂盒进行细胞活力检测。转染后宫颈癌细胞消化计数以1 000个/100 μl每孔接种于96孔板内，每组设置5个复孔。将细胞放入培养箱中培养，分别在0 h，12 h，24 h，48 h，72 h取出待测96孔板加入CCK-8试剂，10 μl/孔，加入过程避免产生气泡，37℃下孵育3 h，酶标仪吸光度设置为450 nm，检测各组细胞的OD值。

1.8Western印迹检测分析 弃去细胞培养基，PBS清洗3遍，消化，终止离心收集细胞沉淀，放置冰上，加入适量裂解液裂解30 min，样本在4℃，12 000 r/min条件下离心30 min。收集上清，用二喹啉甲酸(BCA)法进行蛋白定量。等量的含结合缓冲液的蛋白样品在金属浴中100℃煮10 min。将冷却的蛋白样本在10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，转膜，5%脱脂牛奶中封闭1 h，鼠抗人的ROR2(1∶1 000)、兔抗人的PCNA(1∶1 000)和GAPGH(1∶5 000)一抗孵育过夜，用PBS清洗聚偏氟乙烯(PVDF)膜3次，每次10 min，孵山羊抗鼠或兔的二抗(1∶5 000)室温1 h，PBS洗膜，曝光，记录结果并对蛋白进行光密度分析。

1.9统计学方法 应用SPSS18.0软件进行配对t检验、χ2检验、Pearson相关分析、方差分析。

2 结 果

2.1ROR2在宫颈癌组织中的表达 宫颈癌组织中ROR2表达显著高于癌旁组织〔(0.955±0.019)vs (0.602±0.108),P<0.001〕。绝经后激素调节、肿瘤大小为ROR2表达的显著影响因素(P<0.01)；ROR2表达与淋巴结转移和FIGO分期无显著相关性(P>0.05)，见表1。

表1 ROR2表达与临床病理因子相关性(n)

2.2沉默ROR2对细胞增殖的影响 Mock组、Sictrl组、SiRNA1组、SiRNA2组ROR2蛋白表达分别为：35 117.3±120.55、24 736.9±111.58、6 495.6±33.99、9 743.0±52.39。在SiHa细胞中转染两对ROR2 siRNA后ROR2的表达明显受到抑制(P<0.001)。见图1。两对ROR2 siRNA均明显抑制了SiHa细胞的增殖能力(P<0.001)。见图2。

图1 Western印迹检测各组ROR2蛋白表达

1)P<0.001图2 SiHa细胞转染ROR2 siRNA后对细胞增殖能力的影响

2.3沉默ROR2对增殖蛋白PCNA的影响 Mock组、Sictrl组、SiRNA1组、SiRNA2组PCNA蛋白表达分别为：0.987±0.116、1.089±0.185、0.279±0.117、0.107±0.095。两对ROR2小干扰RNA均明显的抑制了SiHa细胞中PCNA蛋白的表达(P<0.001)。见图3。

图3 Western印迹检测各组PCNA蛋白表达

3 讨 论

宫颈癌传统的治疗手段以手术治疗和放化疗为主，但其预后远未达到令人满意的程度。随着人类对生命科学的深入了解和科学技术的进步，基因治疗已经成为宫颈癌治疗的一种新模式，而筛选理想的靶基因是正在研究的热点。

多种酪氨酸激酶已经证实在细胞增殖、极化、迁移、代谢等生物过程发挥重要作用，而它们的异常活化会导致细胞增殖调节发生紊乱，致使肿瘤发生。ROR2属于受体酪氨酸激酶超家族，已经证实在多种恶性肿瘤中表达明显上调，并且ROR2的高表达与这些患者的预后差密切相关，例如结直肠癌〔4〕，非小细胞肺癌〔5〕，胰腺导管腺癌〔6〕，胃肠道基质肿瘤〔7〕，骨肉瘤〔8〕，宫颈癌〔3〕。本研究结果表明ROR2在老年宫颈癌组织中高表达，与ROR2在宫颈癌中的表达结果报道一致〔3〕，且与分化程度和肿瘤大小明显相关，提示ROR2在老年宫颈癌发生发展中可能扮演重要角色。

ROR2的生物学功能也在多种肿瘤中被广泛研究〔2〕，例如：下调ROR2的表达后可以抑制卵巢癌细胞的侵袭和黏附〔9〕；相反，过表达ROR2可以促骨肉瘤细胞的生长〔10〕。然而，ROR2的表达是否会影响宫颈癌的生物进程至今没有报道。肿瘤的一大特点就是调控细胞生长的基因异常表达，导致肿瘤细胞不可控制的生长。为排除脱靶效应，设计了两对ROR2的siRNA，并通过Western印迹检测两对ROR2 siRNA的干扰效率，发现沉默ROR2后，宫颈癌细胞SiHa的增殖明显受到了抑制，与ROR2在其他肿瘤细胞研究结果一致。PCNA是真核生物复制复合体的核心成分，已报道PCNA可以参与DNA损伤修复、细胞凋亡等许多重要的细胞事件，另外作为细胞增殖的指标〔11〕。本研究发现ROR2被沉默后，PCNA的表达明显被抑制，提示ROR2可能通过调控PCNA表达影响宫颈癌细胞增殖。