慢性饮酒及戒断对老年大鼠学习记忆的影响

刘国良 林玲

(河南医学高等专科学校，河南 郑州 450003)

由于慢性饮酒而导致酒精成瘾，对身体各项功能造成严重危害，对神经系统的损害尤为严重，表现为各种认知功能障碍。研究表明〔1,2〕，酒精对神经系统损伤的机制之一是乙醇的代谢产物乙醛等具有脂溶性和水溶性双向特征，可以通过血脑屏障，并对中枢神经递质系统产生严重影响，最终导致机体出现多种神经行为改变。文献报道，急性、慢性酒精成瘾都可造成大鼠学习记忆能力下降〔3,4〕，目前关于酒精成瘾机制的研究很多，包括神经递质、受体及信号转导通路等，但从突触可塑性的角度进行探讨相对较少。本实验通过建立慢性酒精依赖老年大鼠及戒断模型，并观察酒精依赖及戒断后老年大鼠学习记忆能力的改变及海马突触可塑性、突触可塑性蛋白(PSD-95)表达的变化，探讨慢性酒精依赖影响老年大鼠学习记忆损伤的可能机制。

1 材料和方法

1.1药品和试剂 无水乙醇(郑州中博化工有限公司)；兔抗PSD-95多克隆Ⅰ抗(Abcam公司，USA)，细胞裂解液、异硫氰基荧光素(FITC)标记的羊抗兔荧光Ⅱ抗、TritonX-100、牛血清白蛋白(BSA)等均购于碧云天生物科技有限公司，其他试剂均采用国产分析纯。Morris水迷宫(北京医学科学院药物研究所研制)；BL-420s生物信号分析系统(成都泰盟科技有限公司)；荧光显微镜(OLYMPUS)，冰冻切片机(OLYMPUS)，大鼠脑立体定位仪(安徽正华生物仪器设备有限公司)。

1.2方法

1.2.1动物及分组 36只老年雄性SD大鼠(18月龄)，SPF级，体重180～220 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号：SCXK(湘)2011-0003。动物饲养环境：通风，自然光照，常规摄食饮水，室温(22±1)℃，适应性饲养1 w后开始实验。分为对照组、乙醇组和戒断7 d组，每组12只。对照组大鼠正常饮水饲养，乙醇组大鼠参照Turchan等〔5〕的方法建立慢性酒精依赖大鼠模型：以6%(V/V)的酒精作为大鼠唯一饮水来源，持续30 d。戒断7 d组大鼠同乙醇组饲养30 d后，恢复正常饮水7 d。每日观察并记录大鼠的饮水及进食量，在实验过程中，大鼠饮水采用带刻度的饮水瓶，日饮水量不足20 ml的大鼠予以剔除。为确保酒精浓度，每日8∶00更换由无水乙醇和双蒸水配制的新鲜酒精溶液。 参照文献〔6〕的方法，造模完成24 h后对乙醇组和戒断7 d组大鼠进行柳田知司评分，在造模过程所有大鼠无死亡。

1.2.2Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力 为尽量减少酒精戒断症状对大鼠学习记忆的干扰，乙醇组大鼠在造模最后4 d(造模第27～30天)、戒断组大鼠在酒精戒断7 d之后进行Morris水迷宫实验，训练共进行4 d，每天2次，每次训练时间间隔15 min。

1.2.3电生理实验 水迷宫实验结束后各组一半大鼠(6只)进行电生理实验。

1.2.3.1动物手术 10%(V/V)水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.3～0.4 ml/100 g)，固定于立体定位仪上，暴露颅骨，参照大鼠脑解剖图谱定位海马CA1区(前囟向后7.5 mm，左旁4.2 mm，颅骨表面向下3.0 mm)，将记录电极置入CA1区，参考电极E1(前囟向前2.0 mm，右旁2.0 mm，颅骨表面向下3.0 mm)植入额叶，两者都以E2(前囟向前2.0 mm，左旁2.0 mm)为参考，牙托粉固定。术后肌注青霉素抗感染，充足食物和水分供应。

1.2.3.2诱发电位的记录 首先记录单个刺激〔波宽0.1 ms，强度为引起最大群体电位(PS)的50%〕诱发的PS幅值。然后用100 Hz 5 s(波宽0.1 ms)的高频刺激(HFS)诱导海马长时程增强(LTP)。以6个时间点的PS幅值的平均值作为自身基础幅值，每个时间点的突触传递水平以相对值(%)表示，相对值=(实测值-相对值)/相对值×100%。

1.2.4免疫荧光实验检测海马CA1区和前额叶皮层PSD-95蛋白表达 将各组剩下的6只大鼠灌注后取脑，置于4% 多聚甲醛溶液中过夜，经30%蔗糖溶液脱水后，用恒温(-20℃)冰冻切片机作冠状切片，厚度30 μm，隔 4片取 1片脑片，切片经0.3%TritonX-100通透2 h，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗5 min/次×3 次，10%BSA封闭1 h，0.01 mol/L PBS漂洗5 min/次×3次。滴加兔PSD-95多克隆抗体(1∶500)4℃ 条件下孵育过夜； 复温后0.01 mol/L PBS漂洗5 min/次×3次。暗室加入FITC标记的羊抗兔二抗(1∶1 000)室温孵育2 h，0.01 mol/L PBS漂洗5 min/次×3 次，防淬灭的封片剂封片，荧光显微镜下观察拍片，每张切片检测海马CA1区和前额叶皮层平均阳性细胞数(IPP6.0软件分析)。

1.2.5数据统计分析 应用SPSS18.0软件进行单因素方差分析、q检验。

2 结 果

2.1柳田知司评分结果 乙醇组的戒断症状评分〔(15.42±2.32)分〕显著高于对照组〔(4.54±1.21)分，P<0.01〕；与乙醇组比较，戒断7 d组戒断症状评分显著降低〔(6.06±1.31)分，P<0.01〕。

2.2各组逃避平台潜伏期比较 第2～4天，乙醇组逃避潜伏期时间较对照组明显延长(均P<0.05)；戒断7 d组逃避潜伏期时间较乙醇组明显缩短(均P<0.05)，但显著长于对照组(均P<0.05)。见表1。

2.3各组LTP幅值增加相对值比较 与对照组相比，乙醇组LTP幅值增加相对值明显降低(P<0.05)，戒断7 d组LTP幅值增加相对值较乙醇组明显升高(P<0.05)。见图1。

表1 各组逃避平台潜伏期时间比较

与对照组比较：1)P<0.05；与乙醇组比较：2)P<0.05；表2同

与对照组比较：1)P<0.05；与乙醇组比较：2)P<0.05图1 各组HFS前后海马CA1区诱发电位主波幅值的变化

2.4各组PSD-95蛋白表达比较 海马CA1区和前额叶皮层神经元胞质内可见FITC标记的绿色荧光免疫反应阳性产物为PSD-95蛋白，对照组PSD-95阳性细胞荧光染色强，而乙醇组PSD-95阳性细胞荧光染色浅；与乙醇组比较，戒断7 d组PSD-95阳性细胞荧光染色强(图2，图3)。与对照组比较，乙醇组阳性细胞数明显减少(P<0.05)，积分光密度显著减弱(P<0.05)，与乙醇组比较，戒断7 d组阳性细胞数明显增加(P<0.05)，积分光密度明显增强(P<0.05)。见表2。

图2 各组海马CA1区PSD-95蛋白表达(×400)

图3 各组前额叶皮层PSD-95蛋白表达(×400)

表2 各组前额叶皮层和海马CAI区PSD-95免疫反应阳性细胞计数、平均积分光密度比较

3 讨 论

海马和前额叶皮层都是神经元突触可塑性的重要区域，与学习记忆的形成密切相关。长期饮酒可导致海马神经元的丢失，进而导致学习记忆能力减退〔7～10〕。本实验用6%的酒精作为老年大鼠唯一的饮水来源连续饮用30 d来模拟慢性酒精依赖的大鼠模型，结果显示，乙醇组大鼠在酒精戒断24 h后出现明显的戒断症状：异常姿势、高激惹性和体重减轻等，说明实验造模成功。本实验Morris水迷宫结果说明酒精依赖大鼠空间记忆能力明显减退，实施酒精戒断以后，老年大鼠的空间记忆能力得到一定的改善。

LTP是学习记忆的神经基础，也是突触可塑性的重要表现〔11，12〕。在本实验中，强直性高频刺激在3组动物海马CA1区均可诱导出稳定的LTP样电位变化，说明3组动物海马神经元均具有突触可塑性，LTP幅值升高程度说明酒精依赖对海马神经元的损伤，使其可塑性下降。

突触后致密物PSD是位于突触活性区突触后膜与胞质相连的一层致密物，是突触可塑性的关键分子。研究表明，PSD-95能够促进突触前膜突触素的表达增加，增强AD大鼠的空间记忆能力〔13〕。尹美芳〔14〕研究表明，PSD-95参与了长期饮酒导致海马突触可塑性及空间记忆能力的损伤。前额叶皮层在动物空间记忆的行程中也具有非常重要的作用〔15〕。本实验结果说明慢性酒精依赖可使学习记忆相关递质PSD-95的释放减少，最终使老年大鼠的空间记忆能力减退。

本实验从行为学、在体电生理、免疫荧光等方法证实了老年慢性饮酒导致大鼠的空间记忆能力减退，其原因可能与慢性饮酒导致老年动物海马和前额叶皮层神经元损伤、学习记忆相关递质的释放减少、突触可塑性下降有关，但其更深的作用机制还有待进一步研究。