三磷酸腺苷结合盒G2调控肝癌细胞多药耐药的作用

赵鑫 陈乐彤 王静 刘亮

(1河北省人民医院超声科，河北 石家庄 050000；2河北医科大学第四医院肿瘤研究所)

肝癌是世界范围内常见的恶性肿瘤，具有发病率高、病死率高的特点〔1〕。手术、介入治疗、靶向药物治疗及放化疗是目前肝癌的常规治疗方法。一些晚期肝癌患者或因其他原因无法行手术、介入治疗的患者，化疗成为其主要的治疗方法。影响肝癌化疗效果的因素有很多，其中药物的毒副作用及肝癌细胞对化疗药物的耐药是较重要的影响因素。探索肝癌多药耐药产生机制从而对其靶向干预，可以有效提高化疗效果。目前研究发现，三磷酸腺苷结合盒(ABC)在肿瘤多药耐药产生过程中起着重要作用〔2，3〕，可以有效降低肿瘤细胞内的化疗药物浓度，从而产生耐药，其中ABCB1及ABCG2与肿瘤多药耐药关系最为密切〔4～6〕。ABCG2参与多种肿瘤的多药耐药形成，且是侧腹群(SP)细胞主要标志物〔7～9〕，参与肿瘤干细胞的形成；而ABCG2与肝癌多药耐药关系的研究鲜有报道。本文主要探讨肝癌多药耐药形成机制。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器 ABCG2(5D3)抗体购自美国Santa cruz公司；FITC标记的二抗购自美国Jackson ImmunoResearch；碘化丙啶(LOT：5338528)购自美国BD公司；FC500型流式细胞仪，美国Beckman Coulter公司。

1.2肝癌耐药细胞培养 利用药物浓度递增细胞培养方法建立肝癌耐药细胞，在肝癌细胞SMMC-7721培养液中加入阿霉素(ADM)，逐渐提高ADM浓度，浓度从0.001 μg/ml 提高至0.100 μg/ml，使细胞在0.100 μg/ml ADM中稳定生长，命名为SMMC-7721/ADM 细胞。

1.3MTT法检测ADM对肝癌细胞生长的抑制作用 将细胞浓度为1×104个/ml且处于对数生长期的SMMC-7721或SMMC-7721/ADM细胞接种于96孔培养板中，待细胞贴壁后弃去上清液，分别加入不同浓度的ADM(0.001、0.005、0.010、0.050、1.000、5.000、10.000、50.000 μg/ml)，阴性对照组加入等体积生理盐水，每孔总体积为200 μl，同时设置只加培养基的空白对照孔，每个药物剂量设3个复孔，作用24 h后，弃去培养液，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，培养液180 μl，继续孵育4 h后终止培养，弃去培养液，每孔加入180 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min。以空白孔调零，选择490 nm波长，在酶标仪上测定各孔光密度值A490。生长抑制率计算公式：生长抑制率(IR，%)=(1-用药组A490/对照组A490)×100%。

1.4倒置显微镜下观察SMMC-7721/ADM及其亲代SMMC-7721细胞形态 将细胞浓度为1×105个/ml且处于对数生长期的SMMC-7721或SMMC-7721/ADM细胞接种于细胞培养瓶中，待细胞贴壁后利用倒置显微镜观察细胞形态并拍照。

1.5流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡及细胞周期 将细胞浓度为1×106个/ml且处于对数生长期的SMMC-7721及SMMC-7721/ADM细胞，利用冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次(1 000 r/min，5 min)，取1 ml细胞悬液，向其中加入DNA染液(碘化丙啶)1 ml，而后避光4℃染色30 min，利用冷PBS洗涤1次(1 000 r/min，5 min)，1 ml PBS悬浮细胞，上机流式细胞仪检测。

1.6FCM检测细胞中ABCG2蛋白表达 将细胞浓度为1×106个/ml且处于对数生长期的SMMC-7721及SMMC-7721/ADM细胞，利用冷PBS洗涤1次(1 000 r/min，5 min)，取细胞悬液1 ml，利用冷PBS洗涤1次(1 000 r/min，5 min)，100 μl PBS悬浮细胞，100 μl ABCG2抗体加入细胞悬液中，室温孵育30 min，而后PBS洗涤细胞1次(1 000 r/min，5 min)，100 μl PBS悬浮细胞，100 μl FITC标记的二抗加入细胞悬液中，室温避光孵育30 min，利用冷PBS洗涤1次(1 000 r/min，5 min)，1 ml PBS悬浮细胞，上机流式细胞仪检测。以平均荧光强度表示细胞中蛋白表达量。

1.7统计学分析 采用SPSS11.5软件行独立样本t检验。

2 结 果

2.1MTT实验检测ADM抑制肝癌SMMC-7721细胞生长的IC50 MTT检测结果显示，ADM作用肝癌SMMC-7721细胞24 h的半数生长抑制浓度(IC50)为(1.11±0.09)μg/ml。

2.2肝癌耐药细胞培养及形态学观察 利用药物浓度递增细胞培养方法，历时3个月，使细胞在0.1 μg/ml ADM中稳定生长，命名为SMMC-7721/ADM 细胞。倒置显微镜下观察SMMC-7721/ADM细胞形态更不规则，细胞体积变大，细胞间隙增大，见图1。

2.3MTT实验检测ADM抑制肝癌SMMC-7721/ADM细胞生长的IC50 不同浓度ADM作用SMMC-7721/ADM细胞24 h，IC50=(23.04±0.26)μg/ml。SMMC-7721/ADM细胞与其亲代SMMC-7721细胞相比，对ADM的耐药指数为20.76。

图1 倒置显微镜下观察细胞形态(×100)

2.4流式细胞术检测细胞凋亡率 SMMC-7721/ADM细胞凋亡率(0.82±0.12)%，与其亲代SMMC-7721细胞凋亡率(0.84±0.14)%相比无显著性差异(P>0.05)。

2.5流式细胞术检测细胞周期 SMMC-7721/ADM细胞周期G0/G1期(46.86±0.49)%、S期(38.71±2.66)%及G2/M期(14.43±2.17)%；SMMC-7721细胞周期G0/G1期(49.97±0.51)%、S期(37.85±2.31)%及G2/M期(12.18±1.79)%。SMMC-7721/ADM细胞与其亲代SMMC-7721细胞相比G0/G1期显著减少(P<0.05)；而S期及G2/M期增高，但无统计学意义(P>0.05)。

2.6肝癌耐药细胞及其亲代细胞中ABCG2 蛋白表达 肝癌耐药细胞SMMC-7721/ADM中ABCG2 蛋白表达水平(377.58±3.01)显著高于其亲代细胞SMMC-7721中的表达水平(332.50±13.96，P<0.05)。

3 讨 论

目前引起肿瘤细胞多药耐药机制中研究较多且得到广大研究者公认的机制主要有三方面，第一，细胞膜转运蛋白介导的药物外排机制；第二，凋亡调控基因调控机制，通过凋亡调控基因的调控使细胞逃脱药物引起的细胞凋亡；第三，细胞酶调控机制。大量的文献〔9～11〕显示，细胞跨膜蛋白介导的细胞药物外排作用，引起细胞内药物的有效浓度降低，从而引起细胞耐药的机制与大量癌细胞耐药有关。细胞跨膜蛋白可以主动逆浓度梯度将细胞内药物泵出到细胞外，从而降低细胞浓度。研究显示，这类与细胞耐药有关的跨膜蛋白多为ABC转运蛋白家族成员〔10,11〕。而在ABC转运蛋白家族中研究较多的与肿瘤细胞多药耐药有关的蛋白为ABCB1及ABCG2。

ABCG2与多种肿瘤细胞的多药耐药有关〔12,13〕，参与了肿瘤SP细胞形成并与肿瘤干细胞有关〔4,14〕。本研究结果显示，SMMC-7721/ADM细胞对ADM产生耐药，其耐药机制考虑为细胞中ABCG2高表达从而引起外排ADM作用增强，导致细胞内ADM的有效浓度降低，从而产生耐药。