当归挥发油对自发性高血压大鼠脂质代谢相关基因Tnfaip8l2、Ahsg表达的影响

曲强 纪禄风 伊琳

(1甘肃中医药大学中西医结合学院，甘肃 兰州 730000；2甘肃省人民医院急诊科)

原发性高血压(EH)作为心血管病的危险致病因素之一，常引起心、脑、肾等多个靶器官的损害〔1〕。脂质代谢紊乱是高血压发生的易患因素〔2〕，高血压和脂质代谢紊乱经常合并存在，联系紧密。它们能够共同影响如缺血性心肌病、脑血管意外、肾脏损害(缺血性)等疾病的进程。大量的研究表明体重减轻会降低血压〔3〕。

当归是甘肃的道地药材，对心脑血管及血液代谢等方面具有调节作用。本实验小组前期研究〔4〕证实当归具有辅助降压的作用，并且在分析当归处理自发性高血压大鼠(SHR)的基因表达谱中发现了肿瘤坏死因子α诱导8样分子2(Tnfaip8l2)基因。前期基因芯片研究中，笔者也发现当归可使血清胎球蛋白A(Ahsg)、Toll样受体(TLR)3等动脉粥样硬化抑制因子的表达上调〔5〕。根据最新进展〔6〕笔者发现，高脂饮食诱导小鼠模型时，当归能抑制其体重增长，改变脂肪组织相关性基因的表达，并对肥胖症的发展起到了抑制作用。本研究通过分析当归挥发油对SHR肝脏脂质代谢相关基因Tnfaip8l2、Ahsg表达的影响，阐述当归挥发油对SHR脂代谢的改善作用及其机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 24只SPF级雄性SHR，8周龄，体重180～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限责任公司,动物合格证号SCXK(京)2012-0001，动物检疫合格证No.1100562901。8只SPF级正常血压雄性Wistar大鼠，体重180～220 g，购自甘肃中医药大学实验动物中心，动物合格证号SYXK(甘)2011-0001。

1.1.2实验药物与试剂 当归购自甘肃省岷县，采用超临界二氧化碳(CO2)萃取法，由甘肃中医药大学科研实验中心提取当归挥发油(藁本内酯含量>75%)。阿托伐他汀钙片(北京嘉林药业股份有限公司，国药准字H19990258)，Tnfaip8l2、Ahsg抗体(北京博奥森生物有限公司)，Tnfaip8l2引物(TaKaRa公司，货号5005)，Ahsg引物(易锦生物，货号RmiRQ9003)，qRT-PCR仪(美国，伯乐，货号SORVALL TENSCO)，高效RIPA裂解液(索莱宝，货号R0010)，BCA浓度测定试剂盒(索莱宝)，聚丙酰胺配胶试剂盒(索莱宝)，Western印迹仪(美国，伯乐)，Power Lab ML125/R无创尾动脉血压器(澳大利亚，AD Instruments公司)，低温摇床，低温离心机。

1.2方法

1.2.1分组和给药 本研究的起止时间为2017年10月至2018年4月，实验周期为6个月。将SHR和Wistar大鼠于SPF级动物房适应性饲养1 w后，将SHR随机分为模型组、当归挥发油组、阿托伐他汀钙组，每组8只；Wistar大鼠作为对照组。模型组、对照组不给予任何药物处理。当归挥发油组、阿托伐他汀钙组根据实验鼠体表面积最终确定给药剂量，分别给予当归挥发油乳剂(吐温-80助溶)100 mg/(kg·d)(含10%当归挥发油)、阿托伐他汀钙溶液60 mg/(kg·d)灌胃。每日给药1次，每周给药7 d，连续给药4 w，并随着大鼠体重变化每周按时调整给药剂量。每周第7天检测大鼠尾动脉血压，每周于同一时间点进行测量，每只大鼠每次测量血压5次，取平均值记录。实验给药期间，各组大鼠标准饮食，自由饮水。

1.2.2样本采集及检测方法

1.2.2.1血样采集及血脂检测 给药4 w后将大鼠禁食、不禁水12 h，采用3%水合氯醛(避光)腹腔注射，麻醉后腹主动脉采血并分离血清，用Lisa300全自动生化分析仪检测血清总胆固醇(TC),三酰甘油(TG)，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。

1.2.2.2肝脏标本的制备 腹主动脉采血后将大鼠颈椎脱臼处死，开胸取出肝脏组织，10%甲醛溶液固定，石蜡组织包埋对肝脏组织进行HE染色，观察肝脏组织病理学变化。

1.2.2.3肝脏蛋白的提取与检测 大鼠处死后，取肝脏组织50 mg，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后，加0.5 ml高效RIPA裂解液(含1%PSMF)冰上裂解20 min，4℃离心(13 000 r/min，10 min，d=12.5 cm)后得上清液为总蛋白，95℃水浴锅煮10 min，同时采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，根据蛋白浓度计算上样量，而后采用免疫印迹法检测Tnfaip8l2、Ahsg蛋白水平。以GAPDH 作为内参照，进行半定量分析，比值表示其相对含量。

1.2.2.4肝脏总RNA的提取与检测 采用qRT-PCR法检测大鼠Tnfaip8l2、Ahsg mRNA表达水平。取SHR肝脏组织50 mg，DEPC水冲洗后，按TRIzol一步法提取总RNA，紫外分光光度计测其纯度与浓度，其中260/280的比值在1.8～2.0代表其纯度较好；采用1%琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性。总RNA提取后，采用颈环结构的MegaPlexTMRNA反转录引物混合物进行反转录，反转录结束后按照miRNA RT-PCR反应体系进行扩增，以GAPDH作为内参对照，进行PCR产物的半定量分析，反应条件为95℃ 10 min(预变性)，95℃ 15 s(变性)，60℃ 30 s(退火),75℃ 30 s(延伸)，75℃ 1 min(终极延伸)，共40个循环，引物序列：Tnfaip8l2正向：5′-AGTCCTGTTCCACCCGATCAC-3′;反向：5′-CACTATTCGAAATCCACTTGACCTG-3′;Ahsg正向:5′-GGTGCTCCTTTGTTTTGCTC-3′，反向:5′-CAGCCTGAATCCCTGAAGGG-3′;GAPDH正向:5′-AGGCCGGTGCTGAGTATGTC-3′，反向5′-CTGCCTGAATCCCTGAAGAA-3′。采用2-△△ct法计算Tnfaip8l2、Ahsg mRNA的表达水平。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0软件，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析及重复测量方差分析，并行两两比较。

2 结 果

2.1各组用药前后收缩压比较 各组给药情况和时间在大鼠收缩压中主效应显著，差异有统计学意义(P<0.05)。给药第1、2、3、4周，当归挥发油组收缩压均明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，阿托伐他汀钙组收缩压与模型组对比无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组鼠尾动脉收缩压比较

与模型组比较：1)P<0.05；下表同

2.2各组血脂水平比较 与对照组比较，模型组血清TC、TG、LDL-C水平高于对照组，血清HDL-C低于水平组，但无统计学差异(P>0.05)；与模型组比较，各用药组的TC、TG、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，但也未见显著性差异(P>0.05)。见表2。

2.3当归挥发油对各组肝脏组织形态学的影响 对照组肝小叶结构正常，肝细胞正常。与对照组比较，模型组可见脂肪变性，肝细胞内有小泡。当归挥发油组可见肝窦扩张，糖原分解，脂肪变性消失。阿托伐他汀钙组未见明显异常。见图1。

表2 各组血脂水平比较

图1 各组肝脏组织形态学比较(HE，×400)

2.4各组肝脏Tnfaip8l2 及Ahsg mRNA水平比较 与模型组比较，当归挥发油组、阿托伐他汀钙组的Tnfaip8l2及Ahsg mRNA表达水平均明显升高，对照组Tnfaip8l2 mRNA水平明显升高、Ahsg mRNA水平明显减少(P<0.05)，当归挥发油组、阿托伐他汀钙组之间Tnfaip8l2及Ahsg mRNA表达水平比较无统计学差异(P>0.05)。见表3，图2。

表3 各组Tnfaip8l2、Ahsg mRNA相对含量比较

1、2:对照组；3、4：模型组；5、6：当归挥发油组；7、8：阿托伐他汀钙组图2 各组肝脏RNA电泳图

2.5各组肝脏Tnfaip8l2及Ahsg蛋白水平比较 模型组肝脏Ahsg蛋白水平明显高于对照组、Tnfaip8l2蛋白水平明显低于对照组(P<0.05)，当归挥发油组、阿托伐他汀钙组Tnfaip8l2及Ahsg蛋白表达水平均明显高于模型组(P<0.05)，当归挥发油组与阿托伐他汀钙组间比较无统计学差异(P>0.05)，见图3，表4。

图3 各组肝脏Tnfaip8l2、Ahsg蛋白相对含量的表达

表4 各组Tnfaip8l2、Ahsg蛋白相对含量比较

3 讨 论

随着全球高血压患病率的不断上升，高血压的治疗方案已经不能满足人们对健康的需求。中医“治病求本”和“未病先防”的理念为中药治疗高血压病带来了新的契机。当归挥发油的主要成分是藁本内酯及阿魏酸钠，可清除体内氧自由基，降低氧化应激性损伤与抗细胞凋亡，缓解脑细胞的损伤。当归制剂在降低血压及改善临床症状上具有明显的疗效,对调节血脂异常和免疫功能方面具有双向作用,对致动脉粥样硬化指数及血液流变学指标有一定的下调作用〔7〕。并且有研究发现，当归与苯那普利联合降压效果明显好于单用苯那普利的疗效〔8〕。血管内皮功能很可能是高血压与高脂血症联系的纽带。血管腔的表面覆盖着内皮组织，具有调节动脉血管收缩性、 稳定血流及重塑血管结构等功能。大量文献报道〔9〕证实，血清游离脂肪酸浓度升高对主动脉压力感受反射有急性损害作用。脂代谢出现异常时，伴随着血流动力学改变，易合并动脉粥样硬化等疾患〔10〕。当脂代谢合并动脉粥样硬化时，血压也随之升高。动脉粥样硬化、脂代谢紊乱、高血压常同时存在，并互为因果。吴国泰等〔11〕在研究当归挥发油对高血脂小鼠动脉粥样硬化的保护作用中发现当归挥发油能减轻肝细胞脂肪变性、胸主动脉内膜损伤及心肌纤维化,对动脉粥样硬化斑块形成具有抑制作用。Tnfaip8l2与血脂水平密切相关，Zhang等〔12〕研究发现 Tnfaip8l2 缺陷鼠的颈动脉内膜增生过程加速，认为 Tnfaip8l2 基因是潜在的动脉粥样硬化抑制因子。Ahsg(α-Hs糖蛋白)在肝脏合成，具有抗炎、抑制钙化、抗肿瘤、抑制胰岛素信号通路等作用，与心血管疾病、肝硬化、脂肪肝等疾病密切相关〔13〕。本实验小组前期研究〔5〕证实当归具有辅助降压的作用，同时在分析当归处理后SHR基因表达谱中发现Tnfaip8l2 基因及Ahsg基因为上调的差异表达基因。石向慧等〔14〕发现当归挥发油对SHR脂代谢有调节作用,可能通过上调TRIB1、Tlr3、AHSG等蛋白的表达量而抑制动脉粥样硬化,改善SHR的脂代谢而达到降压的目的。因此，推测当归有可能通过这两个动脉粥样硬化抑制因子发挥作用。本研究显示，Tnfaip8l2、Ahsg蛋白在当归挥发油组、阿托伐他汀钙组表达上调，故推测当归挥发油可能通过影响脂代谢进而抑制动脉粥样硬化来达到降压的目的。经过当归挥发油治疗后，SHR的Tnfaip8l2、Ahsg含量上调，并可能通过某些信号通路或者转导通路发生作用，至于这两个基因是通过何种信号途径实现上调的目的及他们内部的关联，将是笔者下一步研究的重点。总之，当归挥发油在治疗老年病诸如高血压及血脂异常方面具有独特的优势，本课题组将进一步探讨高血压和脂代谢发病的共同机制，并早日应用到临床实践中。