胃腺癌组织中Livin与Survivin的表达及临床意义

刘满华

(咸宁市中心医院 湖北科技学院附属第一医院综合医疗科，湖北 咸宁 437000)

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一〔1〕，仅2015年我国新增胃癌病例近68万例，约50万例因胃癌死亡〔2〕，预后差，其5年生存率仅为7%～34%〔3〕。胃癌的病理类型以胃腺癌最多见，手术切除、化疗等传统治疗方法效果欠佳且难以治愈。多基因、多步骤、多因素共同参与肿瘤的发生、发展，细胞凋亡抑制和过度增殖是肿瘤形成的两大主要机制。Livin和Survivin都属于凋亡抑制蛋白家族(IAPs)中的成员〔4〕，可以直接或间接抑制凋亡信号转导过程中的起始分子天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(Caspases)-9及效应分子Caspase-3/-7的活性，起到抑制细胞凋亡的作用，在肿瘤的发生发展及预后中扮演重要角色。本实验应用免疫组织化学方法检测胃腺癌组织及正常胃组织中Livin及Survivin蛋白的表达情况，旨在探讨二者在胃腺癌发生发展过程中的作用。

1 材料与方法

1.1标本来源 收集咸宁市中心医院2013年6月至2017年8月胃腺癌手术切除标本56例为实验组，其中男36例、女20例，年龄42～75岁，中位年龄63岁。患者均由病理诊断确诊，术前未接受放疗、化疗和(或)免疫治疗。按照国际抗癌联盟(UICC)TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期22例，Ⅲ期24例，无Ⅳ期病例。伴有淋巴结转移者38例，无淋巴结转移者18例。组织学分级高分化3例，中分化14例，低分化29例，未分化10例。

正常胃黏膜组织56例为对照组，取自胃癌行胃切除的近侧断端胃黏膜，断端距癌组织>5 cm，且组织学检查显示为正常胃黏膜。

1.2试剂 Livin兔抗人多克隆抗体(稀释浓度1∶100)、Survivin兔抗人多克隆抗体(稀释浓度1∶100)为武汉博士德生物工程有限公司产品，PV-6000免疫组化试剂盒和3，3′-二氨基联苯胺(DAB)显色剂购自北京中杉金桥技术有限公司。

1.3方法 采用免疫组织化学PV-6000两步法。标本离体后予10%甲醛固定、脱水、石蜡包埋，制成4 μm厚的连续冷冻切片，二甲苯脱蜡至水化，蒸馏水冲洗，0.01 mol/L枸橼酸液高压抗原修复，2 min后自然冷却至室温，3%过氧化氢(H2O2)室温孵育10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2 min×3次。滴加一抗，4℃过夜，PBS冲洗2 min×3次，滴加生物素标记二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗2 min×3次，DAB显色，蒸馏水冲洗，苏木精复染，盐酸乙醇分化，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4评价指标 Livin、Survivin可表达于胞质和(或)细胞核。每张切片随机选择5个高倍视野，每高倍镜视野均计数100个细胞，采用半定量积分法依据染色强度和阳性细胞百分率判断染色结果。按阳性细胞百分率评分：无阳性细胞0分，阳性细胞百分率<10%1分，10%～49% 2分，50%～74% 3分，75%～100% 4分；按染色强度评分：无着色0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。两项评分乘积≥3分判定为阳性，<3分判定为阴性。结果判定由2名有经验的临床病理医师采用双盲法认定。

1.5统计学方法 应用SPSS17.0软件进行χ2检验、Spearman等级相关性检验。

2 结 果

2.1两组Livin及Survivin表达情况 实验组29例(51.8%)Livin蛋白表达阳性；36例(64.3%)Survivin表达阳性，对照组有13例(23.2%)Livin蛋白表达阳性，Survivin表达阳性为15例(26.8%)。Livin与Survivin均主要出现在癌组织中，在间质细胞及临近正常组织中则表达较少甚至不表达。实验组Livin和Survivin蛋白阳性表达率明显高于对照组(均P<0.01)。

2.2胃腺癌组织中Livin与Survivin表达的单因素分析 Livin和Survivin蛋白的表达与肿瘤TNM分期、浸润深度及淋巴结转移呈正相关(P<0.05)，与肿瘤的病理分化程度呈负相关(P<0.05)。两者的表达与性别、年龄、肿瘤大小无关(P>0.05)，见表1。

表1 胃腺癌组织中Livin与Survivin阳性表达的单因素分析(n)

2.3胃腺癌组织中Livin与Survivin表达的关系 Livin蛋白表达阳性的29例胃腺癌组织中有24例Survivin蛋白表达阳性，27例Livin蛋白表达阴性的胃腺癌中有12例Survivin表达阳性，经Spearman等级相关性分析，Livin与Survivin的表达呈显著正相关(r=0.371，P<0.01)。

3 讨 论

凋亡具有独特生物学和形态学特征，是细胞死亡的一种遗传机制〔5〕。细胞凋亡是机体内重要的病理生理过程，在内环境稳定的维持、胚胎的形成和发育等方面扮演着极其重要的角色。凋亡抑制在肿瘤的形成中起着关键作用。

IAPs是一类独立于Bcl-2的抗凋亡蛋白家族，对于目前已发现的其他凋亡抑制因子家族，IAPs抑制细胞凋亡的多样性明显较高〔6〕，近些年来备受人们关注。Livin和Survivin都隶属于IAPs家族，Livin基因位于人类20号染色体q13.3，转录后可生成成熟的mRNA亚型：Livinα和Livinβ，尽管二者在基因编码序列上相差18个氨基酸，但其功能在本质上并没有差别。研究证明，Livin在多种人类恶性肿瘤中特异性高表达，如急性非淋巴细胞性白血病〔7〕、肾癌〔8〕、大肠癌〔9〕、食管癌〔10〕、肝癌〔11〕、前列腺癌〔12〕等，而相应的正常组织中的表达水平极低甚至不表达。Survivin基因亦是IAPs家族中的成员，在迄今发现的凋亡抑制因子中作用最强，不仅可以调节细胞有丝分裂促进细胞增殖，还具有抑制细胞凋亡的功能，在联系细胞周期和细胞凋亡中起重要作用〔13〕。Survivin表达具有高度特异性，在终末分化的成人组织(胸腺、生殖腺除外)不表达，而高表达于胚胎和发育的胎儿组织和多种肿瘤组织中。

本研究结果显示，Livin和Survivin在胃腺癌组织中的阳性表达高于正常胃组织。这与文献报道一致〔14，15〕，由此推断，Livin和Survivin在胃腺癌组织中高表达，可能参与胃腺癌的发生发展。本研究发现，Livin和Survivin两种蛋白在胃腺癌组织中的表达与性别、发病年龄和肿瘤大小无相关性，但与肿瘤TNM分期、浸润深度、淋巴结转移及病理分化程度均有关，这与两者在其他肿瘤组织中的表达特点相似〔16〕。两者与肿瘤转移有密切关系，它们在胃腺癌组织中的高表达可能提示肿瘤具有强转移能力及高侵袭性，推测这与二者具有促进肿瘤细胞增殖的功能有关。另外，本研究还发现，Livin和Survivin蛋白在胃腺癌组织中的表达率随着肿瘤病理分化程度的增高而降低，提示Livin和Survivin两种蛋白在肿瘤的发展过程中起重要作用，它们的表达强度影响肿瘤的恶性程度，有可能成为评价胃癌恶性程度的参考指标之一。

既往研究显示，IAPs影响肿瘤细胞的生物学行为是通过改变细胞凋亡通路实现的〔17〕，目前的相关研究报道大多是抑制IAPs家族中的一种基因。本研究结果提示在胃腺癌中Livin与Survivin的在肿瘤组织中的高表达存在协同性，推断，Livin和Survivin均为IAPs家族的成员，二者在结构上具有相似性，它们的协同表达很可能存在某种共同的信号转导通路抑制细胞凋亡，这与文献〔18〕所报道的在结肠癌中二者的表达具有协同性相似，但是，2种及2种以上基因相互影响的具体作用机制尚不明确，为提供更多的参考依据以证明多基因之间存在协同作用，还需要进一步在分子水平上研究。

综上所述，Livin及Survivin在胃腺癌的发生发展过程中起重要作用。随着研究的不断深入，Livin及Survivin不但可能成为胃腺癌临床诊断、判断疗效及监测预后的可靠指标，还可能为胃腺癌的靶向治疗提供新位点。